La preparación de plásmidos es un método de extracción y purificación de ADN para el ADN plasmídico . Es un paso importante en muchos experimentos de biología molecular y es esencial para el uso exitoso de plásmidos en investigación y biotecnología . [1] [2] Se han desarrollado muchos métodos para purificar el ADN plasmídico de las bacterias . [1] [3] Durante el procedimiento de purificación, el ADN plasmídico a menudo se separa de las proteínas contaminantes y el ADN genómico.
Estos métodos implican invariablemente tres pasos: crecimiento del cultivo bacteriano, recolección y lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico. [4] La purificación de plásmidos es fundamental para la clonación molecular . Un plásmido purificado se puede utilizar para muchas aplicaciones estándar, como la secuenciación y las transfecciones en células.
Los plásmidos casi siempre se purifican a partir de cultivos de bacterias líquidas , generalmente E. coli , que han sido transformadas y aisladas. [5] [6] Prácticamente todos los vectores plasmídicos de uso común codifican uno o más genes de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable , por ejemplo, un gen que codifica la resistencia a la ampicilina o la kanamicina, que permite que las bacterias que se han transformado con éxito se multipliquen sin inhibición. [7] [8] [9] Se supone que las bacterias que no han absorbido el vector plasmídico carecen del gen de resistencia y, por lo tanto, se espera que solo crezcan las colonias que representan transformaciones exitosas. [5] [9] [10] Las bacterias se cultivan en condiciones favorables.
Existen varios métodos para la lisis celular, incluida la lisis alcalina, la lisis mecánica y la lisis enzimática. [11] [12] [13] [14]
El método más común es la lisis alcalina, que implica el uso de una alta concentración de una solución básica, como hidróxido de sodio , para lisar las células bacterianas. [15] [16] [17] Cuando las bacterias se lisan en condiciones alcalinas (pH 12,0-12,5), tanto el ADN cromosómico como las proteínas se desnaturalizan; sin embargo, el ADN plasmídico permanece estable. [16] [17] Algunos científicos reducen la concentración de NaOH utilizada a 0,1 M para reducir la aparición de ssDNA . Después de la adición de un tampón de neutralización que contiene acetato para reducir el pH a alrededor de 7, el ADN cromosómico grande y menos superenrollado y las proteínas forman grandes complejos y precipitan; pero los pequeños plásmidos de ADN bacteriano permanecen en solución. [17] [14]
La lisis mecánica implica el uso de fuerza física, como molienda o sonicación , para descomponer las células bacterianas y liberar el ADN plasmídico. Existen varios métodos de lisis mecánica diferentes que se pueden utilizar, entre ellos la prensa francesa , el batido de perlas y la ultrasonicación . [11] [12] [13] [14]
La lisis enzimática, también llamada lisis de lisozima , implica el uso de enzimas para digerir la pared celular y liberar el ADN plasmídico. [11] La enzima más comúnmente utilizada para este propósito es la lisozima, que descompone el peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram-positivas . La lisozima generalmente se agrega al cultivo bacteriano, seguido de calentamiento y/o agitación del cultivo para liberar el ADN plasmídico. [11] [12] [13] [14]
La preparación de plásmidos se puede dividir en cinco categorías principales según la escala de preparación: minipreparación, midipreparación, maxipreparación, megapreparación y gigapreparación. La elección del método a utilizar dependerá de la cantidad de ADN plasmídico necesaria, así como de la aplicación específica para la que se utilizará. [18] [19]
Existen kits disponibles de distintos fabricantes para purificar el ADN plasmídico, que se nombran según el tamaño del cultivo bacteriano y el rendimiento plasmídico correspondiente. En orden creciente son: miniprep, midiprep, maxiprep, megaprep y gigaprep. El rendimiento del ADN plasmídico variará según el número de copias, el tipo y el tamaño del plásmido, la cepa bacteriana , las condiciones de crecimiento y el kit. [2]
La minipreparación de ADN plasmídico es un aislamiento rápido y a pequeña escala de ADN plasmídico de bacterias . [20] [21] Los métodos de minipreparación comúnmente utilizados incluyen lisis alcalina y kits basados en columna de centrifugación . [3] [22] Se basa en el método de lisis alcalina . El ADN plasmídico extraído resultante de realizar una minipreparación a menudo se denomina "minipreparación". Las minipreparaciones se utilizan en el proceso de clonación molecular para analizar clones bacterianos . Un rendimiento típico de ADN plasmídico de una minipreparación es de 5 a 50 μg según la cepa celular. La minipreparación de una gran cantidad de plásmidos también se puede realizar de manera conveniente en papel de filtro lisando la célula y eluyendo el plásmido en papel de filtro. [21]
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 15 a 25 ml de caldo de lisogenia (LB) y el rendimiento de ADN esperado es de 100 a 350 μg.
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 100 a 200 ml de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 500 a 850 μg.
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 500 mL – 2,5 L de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 1,5 a 2,5 mg.
El volumen inicial del cultivo de E. coli es de 2,5 a 5 L de LB y el rendimiento de ADN esperado es de 7,5 a 10 mg.
Es importante considerar las aplicaciones posteriores del ADN plasmídico al elegir un método de purificación. Por ejemplo, si el plásmido se va a utilizar para transfección o electroporación , es deseable un método de purificación que dé como resultado una alta pureza y bajos niveles de endotoxina. De manera similar, si el plásmido se va a utilizar para secuenciación o PCR, es deseable un método de purificación que dé como resultado un alto rendimiento y contaminantes mínimos. [2] Sin embargo, existen múltiples métodos de purificación de ácidos nucleicos. [23] [24] [25] Todos funcionan según el principio de generar condiciones en las que solo precipita el ácido nucleico, o solo precipitan otras biomoléculas , lo que permite separar el ácido nucleico. [15] [23]
La precipitación con etanol es un método ampliamente utilizado para purificar y concentrar ácidos nucleicos , incluido el ADN plasmídico. [26] El principio básico de este método es que los ácidos nucleicos son insolubles en etanol o isopropanol, pero solubles en agua. Por lo tanto, funciona utilizando etanol como antidisolvente del ADN, lo que hace que precipite de la solución y luego se pueda recolectar por centrifugación . La fracción soluble se descarta para eliminar otras biomoléculas. [27]
La purificación de ácidos nucleicos basada en columnas de centrifugación es un método para purificar ADN, ARN o plásmido de una muestra utilizando un filtro de columna de centrifugación. [25] El método se basa en el principio de unir selectivamente los ácidos nucleicos a una matriz sólida en la columna de centrifugación, mientras que otros contaminantes, como proteínas y sales, se eliminan. Luego, se cambian las condiciones para eluir el ácido nucleico purificado de la columna utilizando un tampón de elución adecuado. [25]
El principio básico de la extracción con fenol-cloroformo es que el ADN y el ARN son relativamente insolubles en fenol y cloroformo, mientras que otros componentes celulares son relativamente solubles en estos solventes. La adición de una mezcla de fenol / cloroformo disolverá los contaminantes proteicos y lipídicos, dejando los ácidos nucleicos en la fase acuosa. También desnaturaliza las proteínas, como la DNasa , lo que es especialmente importante si los plásmidos se van a utilizar para la digestión enzimática . De lo contrario, pueden producirse manchas en la forma restringida por enzimas del ADN plasmídico. [24]
En la extracción basada en perlas, la adición de una mezcla que contiene perlas magnéticas, generalmente hechas de iones de hierro , se une al ADN plasmídico, separándolos de los compuestos no deseados mediante una varilla o soporte magnético. [25] Las perlas unidas al plásmido se liberan luego mediante la eliminación del campo magnético y se extraen en una solución de elución para experimentos posteriores, como la transformación o la digestión por restricción . Esta forma de minipreparación también se puede automatizar, lo que aumenta la conveniencia y reduce el error mecánico.