La activación transcripcional controlada por tetraciclina es un método de expresión génica inducible en el que la transcripción se activa o desactiva de forma reversible en presencia del antibiótico tetraciclina o uno de sus derivados (por ejemplo, doxiciclina ). [1]
La expresión genética controlada por tetraciclina se basa en el mecanismo de resistencia al tratamiento con antibióticos con tetraciclina que se encuentra en las bacterias gramnegativas . En la naturaleza, el promotor P tet expresa TetR (el represor ) y TetA, la proteína que bombea el antibiótico tetraciclina fuera de la célula. [2]
La diferencia entre Tet-On y Tet-Off no es si el transactivador activa o desactiva un gen, como sugiere el nombre; más bien, ambas proteínas activan la expresión. La diferencia se relaciona con su respuesta respectiva a la tetraciclina o doxiciclina (Dox, un análogo de tetraciclina más estable); Tet-Off activa la expresión en ausencia de Dox, mientras que Tet-On se activa en presencia de Dox.
Los dos sistemas de expresión inducible más utilizados para la investigación de la biología de células eucariotas se denominan Tet-Off y Tet-On. [3] El sistema Tet-Off para controlar la expresión de genes de interés en células de mamíferos fue desarrollado por los profesores Hermann Bujard y Manfred Gossen en la Universidad de Heidelberg y publicado por primera vez en 1992. [4]
El sistema Tet-Off utiliza la proteína transactivadora de tetraciclina (tTA) , que se crea fusionando una proteína , TetR (represor de tetraciclina), que se encuentra en la bacteria Escherichia coli , con el dominio de activación de otra proteína, VP16 , que se encuentra en el herpes. virus simplex . [5]
La proteína tTA resultante es capaz de unirse al ADN en secuencias específicas del operador TetO . En la mayoría de los sistemas Tet-Off, se colocan varias repeticiones de dichas secuencias TetO aguas arriba de un promotor mínimo como el promotor CMV. La totalidad de varias secuencias TetO con un promotor mínimo se denomina elemento de respuesta a la tetraciclina (TRE), porque responde a la unión de la proteína transactivadora de tetraciclina tTA mediante una mayor expresión del gen o genes aguas abajo de su promotor.
En un sistema Tet-Off, la tetraciclina y sus derivados pueden reprimir la expresión de genes controlados por TRE. Se unen a tTA y lo hacen incapaz de unirse a secuencias de TRE, evitando así la transactivación de genes controlados por TRE.
Un sistema Tet-On funciona de manera similar, pero de manera opuesta. Mientras que en un sistema Tet-Off, tTA es capaz de unirse al operador sólo si no está unido a la tetraciclina o uno de sus derivados, como la doxiciclina, en un sistema Tet-On, la proteína rtTA es capaz de unirse al operador sólo si está unido por una tetraciclina. Así, la introducción de doxiciclina en el sistema inicia la transcripción del producto genético. A veces se prefiere el sistema Tet-On al Tet-Off por su capacidad de respuesta más rápida.
Los sistemas de expresión Tet-Off también se utilizan para generar ratones transgénicos que expresan condicionalmente genes de interés.
El transactivador Tet-On Advanced (también conocido como rtTA2 S -M2) es una versión alternativa de Tet-On que muestra una expresión basal reducida y funciona a una concentración de Dox 10 veces menor que Tet-Off. Además, se considera que su expresión es más estable en células eucariotas debido a que está optimizado con codones humanos y utiliza tres dominios de activación transcripcional mínimos. Fue descubierto en 2000 como uno de los dos mutantes mejorados por H. Bujard y sus colegas después de una mutagénesis aleatoria de la parte represora Tet del gen transactivador. [6] Tet-On 3G (también conocido como rtTA-V10 [7] ) es similar a Tet-On Advanced pero se deriva de rtTA2 S -S2 en lugar de rtTA2 S -M2. También está optimizado con codones humanos y está compuesto por tres dominios mínimos de activación de VP16. Sin embargo, la proteína Tet-On 3G tiene cinco diferencias de aminoácidos en comparación con Tet-On Advanced, lo que parece aumentar aún más su sensibilidad a Dox. Tet-On 3G es 100 veces menos sensible a Dox y es siete veces más activo que el Tet-On original. [8]
Otros sistemas, como el sistema T-REx de Life Technologies, funcionan de forma diferente. [9] El gen de interés está flanqueado por un promotor CMV aguas arriba y dos sitios TetO2. La expresión del gen de interés está reprimida por la unión de alta afinidad de los homodímeros de TetR a cada secuencia de TetO2 en ausencia de tetraciclina. La introducción de tetraciclina da como resultado la unión de una tetraciclina a cada homodímero de TetR seguida de la liberación de TetO2 por los homodímeros de TetR. La desunión de los homodímeros TetR y TetO2 da como resultado la desrepresión del gen de interés.
Una versión modificada de T-REx es el circuito biológico sintético Linearizer , optimizado para el ajuste de la expresión genética en células eucariotas (levadura en ciernes, humanas, etc.). Al incorporar sitios TetO2 en el promotor que impulsa la expresión de TetR, se crea retroalimentación negativa , lo que garantiza una expresión homogénea (bajo ruido) y una dosis-respuesta lineal a los análogos de tetraciclina. [10]
En los plásmidos más utilizados , el elemento de respuesta a la tetraciclina consta de siete repeticiones de la secuencia TetO bacteriana de 19 pb (TCCCTATCAGTGATAGAGA) separadas por secuencias espaciadoras (por ejemplo: ACGATGTCGAGTTTAC). Es el TetO el que es reconocido y vinculado por la porción TetR de Tet-On o Tet-Off. El TRE generalmente se coloca aguas arriba de un promotor mínimo que tiene una expresión basal muy baja en ausencia de Tet-Off (o Tet-On) unido.
El sistema Tet tiene ventajas sobre los sistemas de expresión genética condicional Cre , FRT y ER (receptor de estrógeno). En los sistemas Cre y FRT, la activación o desactivación del gen es irreversible una vez que se logra la recombinación, mientras que en los sistemas Tet y ER es reversible. El sistema Tet tiene un control muy estricto de la expresión, mientras que el sistema ER tiene algunas fugas. [11] Sin embargo, el sistema Tet, que depende de la transcripción y posterior traducción de un gen diana, no actúa tan rápido como el sistema ER, que estabiliza la proteína diana ya expresada tras la administración de hormonas. Además, dado que la secuencia tet-o de 19 pb está naturalmente ausente en las células de mamíferos, se cree que la pleiotropía se minimiza en comparación con los métodos de control hormonal. Cuando se utiliza el sistema Tet en cultivo celular, es importante confirmar que cada lote de suero fetal bovino se analice para confirmar que las tetraciclinas contaminantes están ausentes o son demasiado bajas para interferir con la inducibilidad.
El mecanismo de acción del efecto antibacteriano de las tetraciclinas se basa en alterar la traducción de proteínas en las bacterias, dañando así la capacidad de los microbios para crecer y repararse; sin embargo, la traducción de proteínas también se ve alterada en las mitocondrias eucariotas , lo que produce efectos que pueden confundir los resultados experimentales. [12]