La desoxirribonucleasa ( DNasa , para abreviar) se refiere a un grupo de glicoproteínas endonucleasas que son enzimas que catalizan la escisión hidrolítica de los enlaces fosfodiéster en la columna vertebral del ADN , degradando así el ADN. La función de la enzima DNasa en las células incluye descomponer el ADN extracelular (ADNec) excretado por apoptosis , necrosis y trampas extracelulares de neutrófilos (NET) de las células para ayudar a reducir las respuestas inflamatorias que de otro modo se provocarían. Se conoce una amplia variedad de desoxirribonucleasas que pertenecen a una de dos familias ( DNasa I o DNasa II ), que difieren en sus especificidades de sustrato , mecanismos químicos y funciones biológicas. Las aplicaciones de laboratorio de la DNasa incluyen la purificación de proteínas cuando se extraen de organismos procarióticos . Además, la ADNasa se ha aplicado como tratamiento para enfermedades causadas por el ADNec en el plasma sanguíneo. Los ensayos de DNasa también están surgiendo en el campo de la investigación.
Los dos tipos principales de ADNasa que se encuentran en los animales se conocen como desoxirribonucleasa I (DNasa I) y desoxirribonucleasa II (DNasa II). Estas dos familias tienen subcategorías dentro de ellas.
El primer conjunto de ADNasas es la ADNasa I. Esta familia estaba formada por DNasa I, DNasa1L1 , DNasa 1L2 y DNasa1L3 . La ADNasa I escinde el ADN para formar dos productos finales de oligonucleótidos con extremos 5'-fosfo y 3'-hidroxi y es producida principalmente por órganos del sistema digestivo . La familia DNasa I requiere cationes Ca2+ y Mg2+ como activadores y se expresan selectivamente. [1] En términos de pH, la familia de ADNasas I está activa en un pH normal de alrededor de 6,5 a 8.
El segundo conjunto de ADNasas es la ADNasa II. Esta familia estaba formada por DNasa II ɑ y DNasa II ꞵ. Al igual que la ADNasa I, la ADNasa II escinde el ADN para formar dos productos finales de oligonucleótidos con extremos 5'-hidroxi y 3'-fosfo. Este tipo de ADNasa se expresa más ampliamente en los tejidos debido a una alta expresión en los macrófagos pero una expresión limitada en el tipo de célula. A diferencia de la ADNasa I, no necesitan cationes Ca2+ y Mg2+ como activadores. [2] En términos de pH , la familia DNAasa II se expresa en pH ácido. El patrón de escisión de la ADNasa II se altera en presencia de dimetilsulfóxido ( DMSO ), que afecta significativamente la estructura del ADN.
Aunque tanto la DNasa I como la II son glicoproteínas endonucleasas, la DNasa I tiene una estructura monomérica tipo sándwich con una cadena lateral de carbohidratos, mientras que la DNasa II tiene una estructura cuaternaria dimérica .
Estructura de la ADNasa I: La ADNasa I es una glicoproteína con un peso molecular de 30.000 Da y una cadena de carbohidratos de 8 a 10 residuos unida a Asn18 (naranja). [3] Es una proteína 𝛼,𝛽 con dos láminas plisadas 𝛽 de 6 hebras que forman el núcleo de la estructura. [4] Estas dos láminas centrales corren paralelas y todas las demás corren antiparalelas. Las láminas con pliegues 𝛽 se encuentran en el centro de la estructura, mientras que las hélices 𝛼 están indicadas por las bobinas en la periferia. La ADNasa I contiene cuatro bolsas de unión de iones y requiere Ca 2+ y Mg 2+ para hidrolizar el ADN bicatenario. [5] Dos de los sitios se unen fuertemente a Ca 2+ mientras que los otros dos coordinan Mg 2+ . Se ha publicado poco sobre el número y la ubicación de los sitios de unión del Mg 2+ , aunque se ha propuesto que el Mg 2+ se encuentra cerca de la bolsa catalítica y contribuye a la hidrólisis. [6] Los dos Ca 2+ se muestran en rojo en la imagen. Están unidos a la ADNasa I en condiciones de cristalización y son importantes para la integridad estructural de la molécula al estabilizar el bucle de superficie Asp198 a Thr204 (cian) y al limitar la región de alta movilidad térmica en el bucle flexible a los residuos Gly97 a Gly102 ( amarillo).
Estructura de la ADNasa II: La ADNasa II contiene una estructura cuaternaria homodimérica que es capaz de unir ADN bicatenario dentro de una arquitectura de abrazadera en forma de U. El interior de la abrazadera en forma de U es en gran medida electropositivo y capaz de unir ADN cargado negativamente. Similar a la DNasa I, la estructura de la DNasa II consiste en una estructura secundaria mixta 𝛼/𝛽 con 9 hélices 𝛼 y 20 láminas plisadas 𝛽. [7] Aunque a diferencia de la DNasa I, la DNasa II no requiere iones metálicos divalentes para la catálisis. [7] La estructura consta del protómero A (cian) y el protómero B (verde). Cada estructura consta de dos motivos catalíticos, que están etiquetados en el protómero B por simplicidad: His100 y Lys102 componen el primer motivo (azul) y His279 y Lys281 componen el segundo motivo catalítico (rojo).
Algunas ADNasas cortan o "escinden" sólo residuos en los extremos de las moléculas de ADN. Este tipo de exonucleasa se conoce como exodesoxirribonucleasas . Otras se escinden en cualquier lugar de la cadena, conocidas como endodesoxirribonucleasas (un subconjunto de endonucleasas ). [8] Algunas ADNasas son bastante indiscriminadas en cuanto a la secuencia de ADN en la que cortan, mientras que otras, incluidas las enzimas de restricción , son muy específicas de secuencia. Otras ADNasas escinden sólo ADN bicatenario , otras son específicas de moléculas monocatenarias y otras son activas hacia ambas.
La acción de la DNasa se produce en tres fases. La fase inicial introduce múltiples mellas en la columna vertebral del fosfodiéster . La segunda fase produce nucleótidos solubles en ácido. La tercera fase, que es la fase terminal, consiste en la reducción de oligonucleótidos, provocando un cambio hipercrómico en los datos UV. [9]
La ADNasa I se dirige predominantemente al ADN bicatenario y, en menor medida, a algo de ADN monocatenario para su escisión. La ADNasa I cataliza la escisión inespecífica del ADN cortando enlaces fosfodiéster en una de las hebras. Su sitio de escisión se encuentra entre el átomo de oxígeno 3′ y el átomo de fósforo adyacente, produciendo oligonucleótidos 3′-hidroxilo y 5′-fosforilo con inversión de configuración en el fósforo. La enzima ADNasa depende de la presencia de un catión divalente , que suele ser Ca 2+ , para funcionar correctamente. El sitio activo de la DNasa I incluye dos residuos de histidina (His134 y His252) y dos residuos ácidos ( Glu 78 y Asp 212), todos los cuales son críticos para la catálisis ácido-base general de los enlaces fosfodiéster. [10]
La desoxirribonucleasa II (DNasa II) también se conoce como desoxirribonucleasa ácida porque tiene una actividad óptima en el entorno de pH bajo de los lisosomas, donde normalmente se encuentra en eucariotas superiores. Algunas formas de ADNasa II recombinante muestran un alto nivel de actividad a pH bajo en ausencia de iones metálicos divalentes, similar a la ADNasa II eucariota. [7] A diferencia de la DNasa I, la DNasa II escinde el enlace fosfodiéster entre el átomo de oxígeno 5' y el átomo de fósforo adyacente, produciendo nucleótidos 3΄-fosforilados y 5΄-hidroxilo.
La ADNasa se usa comúnmente para purificar proteínas extraídas de organismos procarióticos . La extracción de proteínas implica a menudo la degradación de la membrana celular . Es común que la membrana celular degradada y frágil sea lisada , liberando ADN no deseado y las proteínas deseadas. El extracto de proteína de ADN resultante es muy viscoso y difícil de purificar, en cuyo caso se añade ADNasa para descomponerlo. [11] El ADN se hidroliza pero las proteínas no se ven afectadas y el extracto puede someterse a una purificación adicional.
El ADN extracelular (ecDNA) es el ADN que se encuentra en la circulación sanguínea. Aparece como resultado de la apoptosis , necrosis o trampas extracelulares de neutrófilos (NET)-osis de células sanguíneas y tisulares, pero también puede surgir de la secreción activa de células vivas. El ADNc y sus proteínas de unión al ADN designadas pueden activar receptores sensores de ADN, receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Los PRR pueden estimular vías que provocan una respuesta inmune inflamatoria. Como resultado, varios estudios de enfermedades inflamatorias han encontrado que existen altas concentraciones de ecDNA en el plasma sanguíneo. Por este motivo, la DNasa ha demostrado ser un posible tratamiento para la reducción del ecDNA en el plasma sanguíneo. Las ADNasas pueden excretarse tanto intracelular como extracelularmente y pueden escindir el enlace fosfodiéster del ADN . Esta función se puede utilizar para mantener una concentración baja de ecDNA y, por lo tanto, tratar la inflamación. Las enfermedades que resultan de residuos de ADN en la sangre se han abordado utilizando las "propiedades de descomposición" de la ADNasa. Los estudios han demostrado que la DNasa puede actuar como tratamiento al disminuir la viscosidad del moco. [12] [13] La administración de DNasa varía dependiendo de la enfermedad. Puede administrarse y se ha administrado por vía oral , intrapleural, intravenosa , intraperitoneal y por inhalación . [14] Varios estudios continúan examinando la aplicación de la DNasa como tratamiento, así como formas de controlar la salud. Por ejemplo, recientemente, la DNasa derivada de bacterias patógenas se ha utilizado como indicador para el seguimiento de infecciones en heridas. [15]
La fibrosis quística es un trastorno genético que afecta la producción de moco, sudor y fluidos digestivos, haciendo que se vuelvan más viscosos en lugar de lubricantes . Las enzimas DNasa pueden ser inhaladas mediante un nebulizador por quienes padecen fibrosis quística . Las enzimas DNasa ayudan porque los glóbulos blancos se acumulan en el moco y, cuando se descomponen, liberan ADN, lo que aumenta la "pegajosidad" del moco. Las enzimas ADNasa descomponen el ADN y la mucosidad es mucho más fácil de eliminar de los pulmones. Específicamente, la DNasa I, también conocida como medicamento aprobado por la FDA, Pulmozyme (también conocida como dornasa alfa), se usa como tratamiento para aumentar la función pulmonar.
También se ha descubierto que otras enfermedades respiratorias como el asma , [16] el empiema pleural , [12] y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica se ven afectadas positivamente por las propiedades de las ADNasas.
Además, estudios recientes muestran que el activador del plasminógeno tisular intrapleural (tPA), una proteína responsable de la descomposición de los coágulos sanguíneos, combinado con la desoxirribonucleasa aumenta el drenaje pleural, disminuye la duración de la estancia hospitalaria y disminuye la necesidad de cirugía en derrames paraneumónicos y empiema. .
La sepsis es una enfermedad inflamatoria potencialmente mortalcausada por la respuesta extrema del cuerpo a una infección. El cuerpo comienza a atacarse a sí mismo cuando una respuesta inflamatoria abarca el cuerpo humano. Como resultado, los niveles altos de ecDNA se han asociado con el torrente sanguíneo y, por lo tanto, los investigadores han considerado la DNasa como un tratamiento adecuado. Los estudios han demostrado que la DNasa logró alterar los NET y disminuir las respuestas inflamatorias. Se necesita más investigación sobre el tipo y el momento de la administración para establecer aún más la DNasa como tratamiento oficial. [17] [18] [19]
El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune que provoca la generación de autoanticuerpos que causan inflamación que daña los órganos, las articulaciones y los riñones. El LES se ha relacionado con niveles bajos de DNasa I, ya que las células apoptóticas se convierten en autoantígenos en esta enfermedad. La ADNasa I se ha investigado como un posible tratamiento para disminuir la cantidad de desechos apoptóticos en el sistema humano. Se ha sugerido que su dificultad podría deberse a la incapacidad de la enzima para descomponer la membrana celular de la cromatina . Los estudios han mostrado resultados contradictorios sobre este tratamiento; sin embargo, se están realizando más investigaciones para examinar los beneficios terapéuticos de la DNasa I. [14] [18] [20]
Tratamiento antitumoral. Se sabe que la ADNasa tiene efectos antitumorales debido a su capacidad para descomponer el ADN. Se encuentran altos niveles de ADN en la sangre de los pacientes con cáncer, lo que sugiere que la ADNasa I podría ser un posible tratamiento. Todavía no se comprende por qué existen niveles tan altos de ecDNA y si la DNasa actuará o no como un tratamiento eficaz. Varios estudios con ratones han mostrado resultados positivos en la progresión antitumoral utilizando ADNasa I intravenosa. Sin embargo, es necesario realizar más investigaciones antes de presentarlo al público. [21] [14]
El ADN absorbe luz ultravioleta (UV) con una longitud de onda de absorbancia máxima cercana a los 260 nm. Esta absorción se debe a los electrones pi en las bases aromáticas del ADN. En el ADNds, o incluso en las regiones del ARN donde se produce una estructura bicatenaria, las bases están apiladas paralelas entre sí y la superposición de los orbitales moleculares de las bases conduce a una disminución de la absorbancia de la luz ultravioleta. Este fenómeno se llama efecto hipocrómico . Cuando la ADNasa libera nucleótidos del ADNds, las bases ya no están apiladas como en el ADNds, de modo que se minimiza la superposición orbital y aumenta la absorbancia de los rayos UV. Este aumento en la absorbancia es la base de la unidad Kunitz de actividad ADNasa. Una unidad Kunitz se define como la cantidad de enzima añadida a 1 mg/ml de ADN de esperma de salmón que provoca un aumento en la absorbancia de 0,001 por minuto en la longitud de onda de 260 nm cuando actúa sobre ADN altamente polimerizado a 25 °C en NaOAc 0,1 M. (pH 5,0) tampón. El nombre de la unidad reconoce al bioquímico ruso-estadounidense Moses Kunitz , quien propuso la prueba estándar en 1946. [22]
Una preparación enzimática estándar debe ejecutarse en paralelo con una desconocida porque no es posible la estandarización de las preparaciones de ADN y su grado de polimerización en solución.
Difusión enzimática radial única (SRED) Este método simple para medir la actividad de la DNasa I fue introducido por Nadano et al. y se basa en la digestión del ADN en el gel de agarosa por la ADNasa, que está presente en las muestras perforadas en el gel. [14] La actividad de la ADNasa está representada por el tamaño de un pocillo circular dispensado en una capa de gel de agarosa, en el que el ADN teñido con bromuro de etidio se distribuye uniformemente. Después de la incubación, se forma una zona oscura circular a medida que la enzima se difunde desde el pocillo radialmente hacia el gel y escinde el ADN. SRED sufrió muchas modificaciones, lo que condujo a un aumento de la sensibilidad y la seguridad, como la sustitución del bromuro de etidio por SYBR Green I u otras tinciones de gel de ADN. [23]
Ensayo colorimétrico de actividad de ADNasa I
El ensayo cinético colorimétrico de actividad de la ADNasa I se desarrolla para evaluar la estabilidad de la ADNasa I recombinante humana (Pulmozyme). El método se ajustó a partir de un ensayo colorimétrico de actividad enzimática de criterio de valoración basado en la degradación de un complejo de ADN/verde de metilo. [24]
{{cite book}}: |work=ignorado ( ayuda )