X-gal (también abreviado BCIG para 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β- D -galactopiranósido) es un compuesto orgánico que consiste en galactosa unida a un indol sustituido . El compuesto fue sintetizado por Jerome Horwitz y colaboradores en 1964. [1] El nombre químico formal a menudo se acorta a frases menos precisas pero también menos engorrosas como bromocloroindoxil galactósido . La X de indoxilo puede ser la fuente de la X en la contracción X-gal. [¿ especulación? ] X-gal se usa a menudo en biología molecular para probar la presencia de una enzima, β-galactosidasa , en el lugar de su objetivo habitual, un β-galactósido. También se usa para detectar la actividad de esta enzima en histoquímica y bacteriología . X-gal es uno de los muchos glicósidos y ésteres indoxílicos que producen compuestos azules insolubles similares al tinte índigo como resultado de la hidrólisis catalizada por enzimas. [2]
Un compuesto menos utilizado pero muy similar ( quiral ) es el X- -gal (Xαgal, X-alfa-gal), o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-galactopiranósido, que es hidrolizado por la α-galactosidasa ( EC 3.2.1.22) en lugar de la β-galactosidasa (EC 3.2.1.23). [3] [4]
La X-gal es un análogo de la lactosa y, por lo tanto, puede ser hidrolizada por la enzima β-galactosidasa , que escinde el enlace β-glicosídico en la D -lactosa. La X-gal, cuando es escindida por la β-galactosidasa, produce galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol- 1 . Este último luego se dimeriza espontáneamente y se oxida en 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro- índigo - 2 , un producto intensamente azul que es insoluble. La X-gal en sí es incolora, por lo que la presencia de un producto de color azul puede usarse como una prueba para la presencia de β-galactosidasa activa. Esto también permite que la β-galactosidasa bacteriana (llamada lacZ ) se use como reportero en varias aplicaciones. [5]
De manera similar, Xαgal se utiliza como compuesto indicador de la α-galactosidasa (por ejemplo, Mel1 en levadura). [6]
En la clonación de genes , la X-gal se utiliza como una indicación visual de si una célula expresa una enzima β-galactosidasa funcional en una técnica llamada cribado azul/blanco . Este método de cribado es una forma conveniente de distinguir un producto de clonación exitoso de otros que no lo son.
El método de detección azul/blanco se basa en el principio de la α-complementación del gen de la β-galactosidasa, donde un fragmento del gen lacZ (lacZα) en el plásmido puede complementar a otro gen lacZ mutante (lacZΔM15) en la célula. Ambos genes por sí mismos producen péptidos no funcionales, sin embargo, cuando se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene lacZα se transforma en células lacZΔM15 , forman una β-galactosidasa funcional. La presencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse cuando las células se cultivan en placas que contienen X-gal, el producto de color azul precipitado dentro de las células dio lugar a las colonias azules características. Sin embargo, el sitio de clonación múltiple, donde un gen de interés puede ligarse al vector plasmídico, se encuentra dentro del gen lacZα . Por lo tanto, la ligadura exitosa interrumpe el gen lacZα , por lo que la α-complementación también se interrumpe y no se puede formar una β-galactosidasa funcional, lo que da como resultado colonias blancas. Las células que contienen el inserto ligado con éxito se pueden identificar fácilmente por su coloración blanca de las azules fallidas. Ejemplos de vectores de clonación utilizados para esta prueba son pUC19 , pBluescript, pGem-T Vectors, y también requiere el uso de cepas hospedadoras específicas de E. coli como DH5α que porta el gen mutante lacZΔM15 . A menudo, la placa que contiene X-Gal también contiene IPTG (isopropil β- D -1-tiogalactopiranósido). IPTG es un análogo de la estructura química de la lactosa. [7] Sin embargo, IPTG no puede ser hidrolizado por β-galactosidasa. IPTG se utiliza como un inductor que se une al represor lac liberando el ADN y permitiendo la transcripción. Por tanto, la presencia de IPTG en la placa de agar aumenta la síntesis de β-galactosidasa. [8]
X-gal tiene varias variantes, que son moléculas similares con ligeras diferencias que sirven principalmente para producir colores distintos del azul como señal.
En el análisis de dos híbridos , la β-galactosidasa puede utilizarse como un reportero para identificar proteínas que interactúan entre sí. En este método, las bibliotecas de genomas pueden examinarse para la interacción de proteínas utilizando un sistema de levadura o bacteriano. Cuando hay una interacción exitosa entre las proteínas que se examinan, dará como resultado la unión de un dominio de activación a un promotor. Si el promotor está vinculado a un gen lacZ , la producción de β-galactosidasa, que da como resultado la formación de colonias pigmentadas de azul en presencia de X-gal, indicará por lo tanto una interacción exitosa entre proteínas. [15] Esta técnica puede limitarse a la detección de bibliotecas de tamaño inferior a aproximadamente 10 6 . [15] La escisión exitosa de X-gal también crea un olor notablemente desagradable debido a la volatilización del indol .
