La ATPasa de tipo vacuolar ( V-ATPasa ) es una enzima muy conservada desde el punto de vista evolutivo y con funciones muy diversas en los organismos eucariotas . [1] Las V-ATPasas acidifican una amplia variedad de orgánulos intracelulares y bombean protones a través de las membranas plasmáticas de numerosos tipos de células. Las V-ATPasas acoplan la energía de la hidrólisis del ATP al transporte de protones a través de las membranas intracelulares y plasmáticas de las células eucariotas. Generalmente se la considera el polo opuesto de la ATP sintasa porque la ATP sintasa es un canal de protones que utiliza la energía de un gradiente de protones para producir ATP. Sin embargo, la V-ATPasa es una bomba de protones que utiliza la energía de la hidrólisis del ATP para producir un gradiente de protones.
La ATPasa de tipo Archaea ( A-ATPasa ) es un grupo relacionado de ATPasas que se encuentran en las arqueas y que a menudo funcionan como una ATP sintasa . Forma un clado V/A-ATPasa con V-ATPasa. La mayoría de los miembros de cualquiera de los dos grupos transportan protones ( H+
), pero algunos miembros han evolucionado para utilizar iones de sodio ( Na+
) en cambio.
Las V-ATPasas se encuentran dentro de las membranas de muchos orgánulos, como endosomas , lisosomas y vesículas secretoras, donde desempeñan una variedad de funciones cruciales para el funcionamiento de estos orgánulos. Por ejemplo, el gradiente de protones a través de la membrana vacuolar de la levadura generado por las V-ATPasas impulsa la absorción de calcio en la vacuola a través de una enzima H+
/California2+
sistema antiportador. [2] En la transmisión sináptica en células neuronales, la V-ATPasa acidifica las vesículas sinápticas. [3] La noradrenalina ingresa a las vesículas por la V-ATPasa [ cita requerida ] .
Las V-ATPasas también se encuentran en las membranas plasmáticas de una amplia variedad de células, como las células intercaladas del riñón , los osteoclastos (células que reabsorben los huesos), los macrófagos , los neutrófilos , los espermatozoides , las células del intestino medio de los insectos y ciertas células tumorales . [4] Las V-ATPasas de la membrana plasmática están involucradas en procesos como la homeostasis del pH , el transporte acoplado y la metástasis tumoral . Las V-ATPasas en la membrana acrosómica del esperma acidifican el acrosoma . Esta acidificación activa las proteasas necesarias para perforar la membrana plasmática del óvulo . Las V-ATPasas en la membrana plasmática de los osteoclastos bombean protones a la superficie del hueso, lo que es necesario para la resorción ósea. En las células intercaladas del riñón, las V-ATPasas bombean protones a la orina , lo que permite la reabsorción de bicarbonato en la sangre. Además, otra variedad de procesos biológicos, como la administración de toxinas, la entrada viral, la orientación a la membrana, la apoptosis, la regulación del pH citoplasmático, el proceso proteolítico y la acidificación de los sistemas intracelulares, son funciones importantes de las V-ATPasas. [5]
Las V-ATPasas también desempeñan un papel importante en el desarrollo de la morfogénesis celular. La alteración del gen vma-1, que codifica la subunidad catalítica (A) de la enzima, afecta gravemente la tasa de crecimiento, la diferenciación y la capacidad de producir esporas viables en el hongo Neurospora crassa. [6]
La V-ATPasa de levadura es la mejor caracterizada. Se han identificado al menos trece subunidades que forman un complejo de V-ATPasa funcional, que consta de dos dominios. Las subunidades pertenecen al dominio V o (subunidades asociadas a la membrana, letras minúsculas en la figura) o al dominio V 1 (subunidades asociadas periféricamente, letras mayúsculas en la figura).
El dominio V 1 incluye ocho subunidades, AH, con tres copias de las subunidades catalíticas A y B, tres copias de las subunidades del estator E y G, y una copia de las subunidades reguladoras C y H. Además, el dominio V 1 también contiene las subunidades D y F, que forman un eje central del rotor. [7] El dominio V 1 contiene isoformas de subunidades específicas de tejido que incluyen B, C, E y G. Las mutaciones en la isoforma B1 dan como resultado la enfermedad humana acidosis tubular renal distal y sordera neurosensorial.
El dominio V o contiene seis subunidades diferentes, a, d, c, c', c", y e, y la estequiometría del anillo c sigue siendo un tema de debate, ya que se postula un decámero para la V-ATPasa del gusano cuerno del tabaco ( Manduca sexta ). El dominio V o de los mamíferos contiene isoformas específicas de tejido para las subunidades a y d, mientras que la V-ATPasa de levadura contiene dos isoformas de subunidades específicas de orgánulos de a, Vph1p y Stv1p. Las mutaciones en la isoforma a3 dan lugar a la enfermedad humana osteopetrosis maligna infantil , y las mutaciones en la isoforma a4 dan lugar a acidosis tubular renal distal, en algunos casos con sordera neurosensorial.
El dominio V 1 es responsable de la hidrólisis de ATP, mientras que el dominio V o es responsable de la translocación de protones. La hidrólisis de ATP en los sitios de unión de nucleótidos catalíticos en la subunidad A impulsa la rotación de un tallo central compuesto por las subunidades D y F, que a su vez impulsa la rotación de un barril de subunidades c en relación con la subunidad a. La estructura compleja de la V-ATPasa se ha revelado a través de la estructura de los complejos M. Sexta y Yeast que se resolvieron mediante crio-EM de partícula única y tinción negativa, respectivamente. [8] [9] [10] Estas estructuras han revelado que la V-ATPasa tiene una red de 3 estatores, unidos por un collar de densidad formado por las subunidades C, H y a, que, aunque dividen los dominios V 1 y V o , no interactúan con el eje del rotor central formado por las subunidades F, D y d. La rotación de este eje central del rotor, causada por la hidrólisis del ATP dentro de los dominios catalíticos AB, da como resultado el movimiento del barril de subunidades c más allá de la subunidad a, lo que impulsa el transporte de protones a través de la membrana. Johnson propuso una estequiometría de dos protones translocados por cada ATP hidrolizado. [11]
Además de las subunidades estructurales de la V-ATPasa de levadura, se han identificado proteínas asociadas que son necesarias para el ensamblaje. Estas proteínas asociadas son esenciales para el ensamblaje del dominio V o y se denominan Vma12p, Vma21p y Vma22p. [12] [13] [14] [15] Dos de las tres proteínas, Vma12p y Vma22p, forman un complejo que se une transitoriamente a Vph1p (subunidad a) para ayudar a su ensamblaje y maduración. [14] [16] [17] [18] Vma21p coordina el ensamblaje de las subunidades V o y escolta el dominio V o hacia las vesículas para su transporte al Golgi . [19]
El dominio V 1 de la V-ATPasa es el sitio de hidrólisis de ATP. A diferencia de V o , el dominio V 1 es hidrófilo. [5] Este dominio soluble consta de un hexámero de subunidades A y B alternadas, un rotor central D, estatores periféricos G y E, y subunidades reguladoras C y H. La hidrólisis de ATP impulsa un cambio conformacional en las seis interfaces A|B y con ello la rotación del rotor central D. A diferencia de la ATP sintasa, el dominio V 1 no es una ATPasa activa cuando se disocia.
La V-ATPasa (Vacuolar-ATPasa) C representa la subunidad C terminal que forma parte del complejo V1 y está localizada en la interfaz entre los complejos V1 y Vo. [21]
La subunidad C desempeña un papel esencial en el control del ensamblaje de la V-ATPasa, actuando como un estator flexible que mantiene unidos los sectores catalítico (V1) y de membrana (VO) de la enzima. [22] La liberación de la subunidad C del complejo ATPasa da como resultado la disociación de los subcomplejos V1 y Vo, que es un mecanismo importante para controlar la actividad de la V-ATPasa en las células . Esencialmente, al crear un alto gradiente electroquímico y un pH bajo, esto impulsa a la enzima a crear más ATP.
Estas subunidades relacionadas forman el tallo o tallos de la A/V-ATPasa. Son importantes para el ensamblaje y pueden funcionar como varillas de empuje en la actividad. E tiene una tapa para conectarse a A/B, mientras que G no la tiene. [20] Es probable que hayan evolucionado a partir de una sola proteína por duplicación genética . [23]
La subunidad H sólo participa en la actividad y no en el ensamblaje. Esta subunidad también actúa como inhibidor de las subunidades V1 libres; detiene la hidrólisis de ATP cuando V1 y Vo se disocian. [24]
El dominio V o es responsable de la translocación de protones. A diferencia de la ATP sintasa de tipo F , el dominio V o generalmente transporta protones en contra de su propio gradiente de concentración. La rotación del dominio V o transporta los protones en movimiento coordinado con el dominio V 1 , que es responsable de la hidrólisis del ATP. El dominio V o es hidrófobo y está compuesto por varias subunidades disociables. [5] Estas subunidades están presentes en el dominio V o para convertirlo en una translocasa de protones funcional; se describen a continuación.
La subunidad de 116 kDa (o subunidad a) y la subunidad I se encuentran en el complejo Vo o Ao de las ATPasas V o A, respectivamente. La subunidad de 116 kDa es una glicoproteína transmembrana necesaria para el ensamblaje y la actividad de transporte de protones del complejo ATPasa. Existen varias isoformas de la subunidad de 116 kDa, que brindan un papel potencial en la orientación y regulación diferencial de la ATPasa V para orgánulos específicos.
La función de la subunidad de 116 kDa no está definida, pero su estructura prevista consta de 6 a 8 sectores transmembranosos, lo que sugiere que puede funcionar de manera similar a la subunidad a de FO.
La subunidad d de las V-ATPasas, llamada subunidad C de las A-ATPasas, es parte del complejo Vo. Se coloca en el medio del anillo c, por lo que se cree que funciona como un rotor. Existen dos versiones de esta subunidad en eucariotas, d/d1 y d2. [25]
En los mamíferos, d1 ( ATP6V0D1 ) es la versión expresada de forma ubicua y d2 ( ATP6V0D2 ) se expresa solo en tipos de células específicos. [25]
De manera similar a la ATP sintasa de tipo F, la región transmembrana de la V-ATPasa incluye un anillo de subunidades que atraviesan la membrana y que son las principales responsables de la translocación de protones. Sin embargo, a diferencia de la ATP sintasa de tipo F, la V-ATPasa tiene múltiples subunidades relacionadas en el anillo C; en hongos como la levadura hay tres subunidades relacionadas (de estequiometría variada) y en la mayoría de los demás eucariotas hay dos.
Las V-ATPasas de levadura no se ensamblan cuando se elimina alguno de los genes que codifican las subunidades, excepto las subunidades H y c". [26] [27] [28] Sin la subunidad H, la V-ATPasa ensamblada no está activa, [13] [29] y la pérdida de la subunidad c" da como resultado el desacoplamiento de la actividad enzimática. [27]
Los mecanismos precisos por los cuales se ensamblan las V-ATPasas aún son controvertidos, y la evidencia sugiere dos posibilidades diferentes. El análisis mutacional y los ensayos in vitro han demostrado que los dominios V o y V 1 preensamblados pueden combinarse para formar un complejo en un proceso llamado ensamblaje independiente. El respaldo del ensamblaje independiente incluye los hallazgos de que el dominio V o ensamblado se puede encontrar en la vacuola en ausencia del dominio V 1 , mientras que los dominios V 1 libres se pueden encontrar en el citoplasma y no en la vacuola . [30] [31] En contraste, los experimentos de pulso-persecución in vivo han revelado interacciones tempranas entre las subunidades V o y V 1 , para ser específicos, las subunidades a y B, lo que sugiere que las subunidades se agregan de manera escalonada para formar un solo complejo en un proceso de ensamblaje concertado. [32]
Una técnica relativamente nueva llamada resurrección de genes ancestrales ha arrojado nueva luz sobre la historia evolutiva de la V-ATPasa. Se ha demostrado cómo la estructura de la V-ATPasa de la forma ancestral que consiste en dos proteínas diferentes evoluciona a la versión de hongos con tres proteínas diferentes. [33] [34] [35] La ATPasa de tipo V es similar a la ATP sintasa arqueal (llamada) de tipo A, un hecho que apoya un origen arqueológico de los eucariotas (como la hipótesis del eocitos , ver también Lokiarchaeota ). La ocurrencia excepcional de algunos linajes de arqueas con tipo F y de algunos linajes de bacterias con ATPasa de tipo A respectivamente se considera como resultado de la transferencia horizontal de genes . [36]
Se sabe que las V-ATPasas son inhibidas específicamente por antibióticos macrólidos, como la concanamicina (CCA) y la balifomicina A 1 . [37] La regulación in vivo de la actividad de la V-ATPasa se logra mediante la disociación reversible del dominio V 1 del dominio V o . Después del ensamblaje inicial, tanto las V-ATPasas de Manduca sexta de insecto como las de levadura pueden desensamblarse reversiblemente en los dominios V o y V 1 libres después de una privación de glucosa de 2 a 5 minutos. [30] El desensamblaje reversible puede ser un mecanismo general de regulación de la actividad de la V-ATPasa, ya que existe en levaduras e insectos. Se propone que el reensamblaje sea ayudado por un complejo denominado RAVE (regulador de H+
-ATPasa de membranas vacuolares y endosómicas). [38] El desmontaje y reensamblaje de las V-ATPasas no requiere la síntesis de nuevas proteínas, pero sí necesita una red microtubular intacta. [39]
La osteopetrosis es un nombre genérico que representa un grupo de enfermedades hereditarias en las que hay un defecto en la resorción ósea osteoclástica . Tanto la osteopetrosis dominante como la recesiva se producen en humanos. [40] [41] La osteopetrosis autosómica dominante muestra síntomas leves en adultos que experimentan fracturas óseas frecuentes debido a huesos frágiles. [40] Una forma más grave de osteopetrosis se denomina osteopetrosis maligna infantil autosómica recesiva. [41] [42] [43] Se han identificado tres genes que son responsables de la osteopetrosis recesiva en humanos. Todos ellos están directamente involucrados en las vías de generación y secreción de protones que son esenciales para la resorción ósea. Un gen es la anhidrasa carbónica II (CAII), que, cuando muta, causa osteopetrosis con acidosis tubular renal (tipo 3). [44] Las mutaciones en el gen del canal de cloruro ClC7 también conducen a osteopetrosis dominante y recesiva. [40] Aproximadamente el 50% de los pacientes con osteopetrosis maligna infantil recesiva tienen mutaciones en la isoforma a3 de la subunidad V-ATPasa. [42] [45] [46] En humanos, se han identificado 26 mutaciones en la isoforma a3 de la subunidad V-ATPasa, que se encuentra en los osteoclastos, que dan lugar a la enfermedad ósea autosómica recesiva osteopetrosis. [42] [41] [45] [47]
La importancia de la actividad de la V-ATPasa en la secreción renal de protones se destaca por la enfermedad hereditaria acidosis tubular renal distal . En todos los casos, la acidosis tubular renal resulta de una falla de los mecanismos renales normales que regulan el pH sistémico. Hay cuatro tipos de acidosis tubular renal. El tipo 1 es la acidosis tubular renal distal y resulta de una falla del conducto colector cortical para acidificar la orina por debajo de un pH de 5. [48] Algunos pacientes con dRTA autosómica recesiva también tienen pérdida auditiva neurosensorial . [49] La herencia de este tipo de RTA resulta de mutaciones en la subunidad V-ATPasa isoforma B1 o isoforma a4 o mutaciones de la banda 3 (también llamada AE1), un intercambiador Cl-/HCO3-. [49] [50] [51] Doce mutaciones diferentes en la isoforma B1 de la V-ATPasa [52] y veinticuatro mutaciones diferentes en a4 conducen a dRTA. [52] [49] Los estudios de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa han demostrado la expresión de la subunidad a4 en la célula intercalada del riñón y en la cóclea . [52] La dRTA causada por mutaciones en el gen de la subunidad a4 en algunos casos puede estar asociada con sordera debido a una falla en la acidificación normal de la endolinfa del oído interno . [51]
La miopatía ligada al cromosoma X con autofagia excesiva es una enfermedad genética rara que resulta de mutaciones en el gen VMA21. [53] La enfermedad comienza en la infancia y provoca una debilidad muscular de progresión lenta, que suele comenzar en las piernas, y algunos pacientes pueden llegar a necesitar asistencia en silla de ruedas con la edad avanzada. La proteína Vma21 ayuda al ensamblaje de la V-ATPasa, y las mutaciones asociadas a XMEA provocan una disminución de la actividad de la V-ATPasa y un aumento del pH lisosomal . [53]
El término V o tiene una letra minúscula "o" (no el número "cero") en subíndice. La "o" representa oligomicina , que se une a la región homóloga de la F-ATPasa . Vale la pena señalar que las notaciones de genes humanos en NCBI lo designan como "cero" en lugar de la letra "o". Por ejemplo, el gen para la subunidad c humana de Vo aparece en la base de datos de genes de NCBI como "ATP6V0C" (con un cero), en lugar de "ATP6VOC" (con una "o"). Muchas publicaciones también cometen este error.