En genética , la recombinación Flp- FRT es una tecnología de recombinación dirigida al sitio , cada vez más utilizada para manipular el ADN de un organismo en condiciones controladas in vivo . Es análoga a la recombinación Cre- lox pero implica la recombinación de secuencias entre sitios de reconocimiento de objetivos de flipasa ( FRT ) cortos por la recombinasa flipasa ( Flp ) derivada del plásmido de 2 μ de la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae .
La secuencia del sitio FRT mínimo de 34 pb tiene la secuencia
para la cual la flipasa (Flp) se une a ambos brazos 5'-GAAGTTCCTATTC-3' de 13 pb que flanquean el espaciador de 8 pb, es decir, la recombinación específica del sitio (región de cruce) en orientación inversa. La escisión mediada por FRT ocurre justo delante de la región central asimétrica de 8 pb ( 5'Tctagaaa3' ) en la cadena superior y detrás de esta secuencia en la cadena inferior. [1] Existen varios sitios FRT variantes , pero la recombinación generalmente puede ocurrir solo entre dos FRT idénticos , pero generalmente no entre FRT no idénticos ("heteroespecíficos") . [2] [3]
En la levadura, esta enzima corrige las disminuciones en el número de copias del plásmido de 2 μ causadas por eventos raros de segregación incorrecta. Lo hace al provocar la recombinación entre las dos repeticiones invertidas en el plásmido de 2 μ durante la replicación del ADN . Esto cambia la dirección de una horquilla de replicación, lo que provoca múltiples rondas de copia en una sola iniciación. [4]
Senecoff et al. (1987) investigaron cómo las sustituciones de nucleótidos dentro del FRT afectaban la eficacia de la recombinación mediada por FLP. Los autores indujeron sustituciones de bases en uno o ambos sitios del FRT y probaron la concentración de FLP necesaria para observar recombinaciones específicas del sitio. Cada sustitución de bases se realizó en cada uno de los trece nucleótidos dentro del sitio del FRT (por ejemplo, G a A, T y C). En primer lugar, los autores demostraron que la mayoría de las mutaciones dentro de la secuencia del FRT causan efectos mínimos si están presentes en solo uno de los dos sitios. Si las mutaciones ocurrieron en ambos sitios, la eficiencia del FLP se reduce drásticamente. En segundo lugar, los autores proporcionaron datos sobre qué nucleótidos son más cruciales para la unión del FLP y la eficacia de la recombinación específica del sitio. Si el primer nucleótido en ambos sitios FRT se sustituye por una citosina (G a C), el tercer nucleótido se sustituye por una timina (A a T) o el séptimo nucleótido se sustituye por una adenosina (G a A), entonces la eficacia de la recombinación específica del sitio mediada por FLP se reduce más de 100 veces. [5] Mientras que una sustitución de bases de cualquiera de los nucleótidos antes mencionados en solo uno de los sitios FRT condujo a una reducción de eficacia de diez, diez y cinco veces, respectivamente. [5]
Las sustituciones de bases en los nucleótidos en mayúsculas provocaron la mayor reducción en la recombinación específica del sitio mediada por FLP (mutante x tipo salvaje y mutante x mutante):
Muchas construcciones disponibles incluyen secuencias de brazos adicionales (5'-GAAGTTCCCTATTCC-3') un par de bases alejado del elemento anterior y en la misma orientación:
Este segmento es prescindible para la escisión, pero esencial para la integración, incluido el intercambio de casetes mediado por recombinasa . [6]
Debido a que la actividad de recombinación puede dirigirse a un órgano seleccionado, o puede usarse un nivel bajo de actividad de recombinación para alterar consistentemente el ADN de solo un subconjunto de células, Flp- FRT puede usarse para construir mosaicos genéticos en organismos multicelulares. Usando esta tecnología , la pérdida o alteración de un gen puede estudiarse en un órgano objetivo de interés dado, incluso en casos en los que los animales experimentales no sobrevivirían a la pérdida de este gen en otros órganos ( control espacial ). El efecto de alterar un gen también puede estudiarse a lo largo del tiempo, utilizando un promotor inducible para desencadenar la actividad de recombinación en una etapa tardía del desarrollo ( control temporal ); esto evita la alteración.
La proteína Flp, al igual que Cre, es una recombinasa específica de sitio de la familia de las tirosinas. [7] Esta familia de recombinasas realiza su función a través de un mecanismo de topoisomerasa tipo IB que provoca la recombinación de dos cadenas separadas de ADN. [7] La recombinación se lleva a cabo mediante un proceso repetido de dos pasos. El paso inicial provoca la creación de un intermedio de unión de Holliday . El segundo paso promueve la recombinación resultante de las dos cadenas complementarias. Como sugiere su nombre de familia, un nucleófilo de tirosina altamente conservado escinde las cadenas de ADN. [7] Las propiedades nucleofílicas de la tirosina atacan y se unen al fosfato 3' en el punto de escisión del ADN. [7] El grupo 5'-hidroxilo resultante del ADN escindido actúa como nucleófilo y ataca al fosfato 3' en la cadena de ADN escindida de manera complementaria, lo que da como resultado una recombinación exitosa. [7] Además del residuo de tirosina, existe una péntada catalítica conservada. Esta péntada está formada por una lisina (Lysβ), dos argininas (Arg I y II), una histidina (His-II) y una histidina/triptófano (His/Trp-III) que comprende una constelación de residuos obligatoria y altamente conservada para el sitio activo de Flp y Cre (junto con otras topiosomerasas IB). [7] Estos otros residuos son cruciales para la orientación correcta de la unión y el posicionamiento de Flp en las cadenas de ADN.
La aplicación inicial de la recombinasa FLP-FRT no funcionó en mamíferos. La proteína FLP era termolábil (se desnaturalizaba a temperaturas elevadas) y, por lo tanto, no era útil en el modelo mamífero debido a las elevadas temperaturas corporales de estos sistemas modelo. Sin embargo, debido a las patentes y restricciones en el uso de la recombinación Cre-Lox, se despertó un gran interés en producir un casete FLP-FRT más termoestable. Algunos de los primeros resultados fueron producidos por Buchholz et al. (1997) utilizando mutagénesis cíclica en Escherichia coli . En su investigación, los autores transfectaron células de E. coli con dos plásmidos: uno que codificaba proteínas FLP mutadas aleatoriamente aguas abajo de un promotor de arabinosa y otro que contenía un promotor del gen lacZ dentro de un casete FRT. Las E. coli se cultivaron en placas de arabinosa a 37 °C y 40 °C, y si se producía la recombinación, la expresión de lacZ se atenuaría y las colonias aparecerían blancas. Se seleccionaron colonias blancas de cada generación y se cultivaron en nuevas placas de arabinosa a las mismas temperaturas anteriores durante ocho generaciones. [8] Después de confirmar la recombinación mediante transferencia Western y secuenciar los genes FLP mutados, esta proteína FLP de octava generación (FLPe) se transfectó en un cultivo de células de mamíferos y se confirmó la recombinación en células de mamíferos. [8] Esta variante de FLP solo tiene 4 sustituciones de aminoácidos: P2S, L33S, Y108N y S294P.
El mosaicismo genético ocurre dentro de un organismo cuando tipos de células similares expresan fenotipos diferentes debido a genotipos diferentes en loci específicos. En pocas palabras, esto ocurre cuando un organismo contiene genotipos diferentes, lo que suele ser poco común en la naturaleza. Sin embargo, esto se puede producir fácilmente (y de manera problemática) utilizando la recombinación FLP-FRT. Si hay dos sitios FRT diferentes dentro de una célula y FLP está presente en concentraciones apropiadas, el casete FRT continuará siendo extirpado e insertado entre los dos sitios FRT. Este proceso continuará hasta que las proteínas FLP caigan por debajo de las concentraciones requeridas, lo que da como resultado células dentro de un organismo que poseen genotipos diferentes. [9] Esto se ha visto desde moscas de la fruta hasta ratones y no discrimina contra cromosomas específicos (somáticos y sexuales) o tipos de células (somáticas y de línea germinal). [9] [10]
Antes de la publicación de Dymecki et al . (1998), la recombinasa Cre se había utilizado para el mapeo del destino celular de los progenitores neuronales en ratones utilizando el promotor En2 . [11] Por lo tanto, los autores de Dymecki et al . (1998) teorizaron que la recombinasa FLP podría utilizarse de manera similar con una eficacia similar a la recombinasa Cre en ratones. Los autores crearon dos líneas de ratones transgénicos: una línea de fusión neuronal Wnt1::Flp y una línea que poseía el casete FRT flanqueando el exón 18 de tm1Cwr . [9] Los autores eligieron este exón para la escisión porque si se escinde, da como resultado un fenotipo nulo. Los autores aparearon las dos líneas y permitieron que la progenie alcanzara la edad adulta antes de sacrificarla. La extracción de ARN se realizó en tejido neuronal, muscular, entérico y de la cola. La PCR con transcripción inversa y el Northern blotting confirmaron la escisión del exón 18 de tm1Cwr en abundancia en el tejido cerebral y moderadamente en el tejido muscular (debido a las células Scwhann dentro del músculo). Como se esperaba, no se observó escisión en otros tejidos. Los autores observaron una eficiencia igual, si no mejor, de la recombinasa FLP en la determinación del destino celular que la recombinasa Cre.
Hasta la fecha, la recombinasa Flp se ha utilizado muchas veces en D. melanogaster. Frickenhaus et al. (2015) [12] publicaron una comparación de la recombinasa Flp con la recombinasa Cre en D. melanogaster . Los autores de Frickenhaus et al. (2015) tenían un doble objetivo: caracterizar y comparar la eficacia de la "eliminación" de la recombinasa Flp con la "eliminación" de la recombinasa Cre y la eliminación mediante RNAi y revelar la función de cabeza (caz), el ortólogo de la mosca de FUS , en las neuronas y el tejido muscular de D. melanogaster . FUS ha sido fuertemente implicado en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal en humanos [12] . Los autores utilizaron un sistema elav - Gal4/UAS -Flp o Cre para expresar la recombinasa específicamente en neuronas y un sistema Mef2 -Gal4/UAS-Flp o Cre para expresarla específicamente en músculos. [12] Los autores concluyen que la herramienta de "knock-out" de la recombinasa Flp es más eficaz que tanto el RNAi como la recombinasa Cre para el propósito de eliminar genes específicos en tejidos o líneas celulares específicos debido a la falta de la expresión permeable observada tanto en la proteína Cre como en la transcripción del RNAi. Además, los autores observaron una toxicidad para la proteína Cre que no se observa con la proteína Flp. [12]
La eficacia del sistema de recombinasa FLPe fue evaluada en pez cebra por Wong et al . (2009). [13] Los embriones, que eran hemicigotos para una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) flanqueada por FRT corriente abajo de un promotor específico del músculo, fueron inyectados con la proteína FLPe. Sin FLPe, estos embriones deberían expresar EGFP en todo el tejido muscular, y si se cruzan con una hebra de tipo salvaje, el 50% de la progenie resultante también debería expresar EGFP en el tejido muscular. Los embriones, inyectados con FLPe, tuvieron una expresión significativamente reducida de EGFP en el tejido muscular, y también se observó mosaicismo. [13] Cuando estos embriones alcanzaron la edad adulta, fueron apareados con una cepa de tipo salvaje, y las nidadas resultantes tuvieron significativamente menos progenie que expresó la EGFP en el tejido muscular (0-4%). [13] Estos resultados muestran que FLPe no solo es altamente eficaz en células somáticas, sino que también es altamente eficaz en la línea germinal del pez cebra.
Los fitosensores son plantas modificadas genéticamente que pueden informar la presencia de contaminantes bióticos o abióticos. [14] La producción de estas plantas modificadas genéticamente tiene una gran promesa en la agricultura y en el laboratorio. Sin embargo, la creación de un vector reportero apropiado ha demostrado ser problemática. Los elementos cis -reguladores juegan un papel importante en la activación transcripcional de genes en plantas, y muchos no se comprenden bien. Muchos fitosensores expresan de forma insuficiente sus genes reporteros o informan de falsos positivos debido a promotores sintéticos. [14] Los autores de Rao et al. (2010) utilizaron la herramienta de recombinasa FLP para la producción de fitosensores altamente eficientes. Los autores utilizaron un promotor de choque térmico para inducir la producción de FLP mientras que un vector flanqueado por FRT separó el promotor CaMV 35S del gen beta-glucuronidasa (GUS). Cuando las plantas se expusieron a un choque térmico, la inducción de FLP provocó la escisión del vector flanqueado por FRT, lo que desplazó de manera efectiva el gen GUS directamente aguas abajo del promotor 35S de CaMV. La activación de GUS provocó que las hojas de las plantas cambiaran de verde a azul; por lo tanto, el fitosensor informó de manera efectiva el estrés al sistema modelo. [14]
La interferencia de ARN (ARNi) ha provocado un cambio de paradigma en la expresión de genes y la posible inactivación de genes en eucariotas. Antes de la producción del sistema de expresión GRIM, la creación de vectores de ARNi era costosa y consumía mucho tiempo. Los vectores se producían mediante el método tradicional de clonación molecular de copiar y pegar. [15] Garwick-Coppens et al . (2011) desarrollaron un método mucho más eficiente para la producción de vectores de ARNi en el que la expresión del ARNi se puede activar mediante la recombinasa Cre y desactivar mediante la recombinasa Flp. El novedoso sistema de expresión GRIM permite la generación mucho más rápida de vectores de expresión que contienen construcciones artificiales de ARNi. [15] Los autores demostraron que su sistema de expresión funciona de manera bastante eficaz en células de riñones embrionarios humanos (HEK), una línea celular humana inmortalizada común en la investigación molecular.