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Intercambio de casetes mediado por recombinasa

RMCE ( intercambio de casetes mediado por recombinasa ) es un procedimiento de genética inversa que permite la modificación sistemática y repetida de genomas de eucariotas superiores mediante integración dirigida, basándose en las características de los procesos de recombinación específicos de sitio (SSR). Para RMCE, esto se logra mediante el intercambio limpio de un casete de gen preexistente por un casete análogo que porta el "gen de interés" (GOI).

La modificación genética de células de mamíferos es un procedimiento estándar para la producción de proteínas correctamente modificadas con relevancia farmacéutica. Para tener éxito, la transferencia y expresión del transgén debe ser muy eficiente y tener un resultado en gran medida predecible. Los avances actuales en el campo de la terapia génica se basan en los mismos principios. Los procedimientos tradicionales utilizados para la transferencia de GOI no son lo suficientemente confiables, principalmente porque las influencias epigenéticas relevantes no se han explorado lo suficiente: los transgenes se integran en los cromosomas con baja eficiencia y en loci que solo brindan condiciones subóptimas para su expresión . Como consecuencia, la información recién introducida puede no realizarse (expresarse), los genes pueden perderse y/o reinsertarse y pueden dejar a las células diana en un estado inestable. Es exactamente en este punto donde RMCE entra en juego. El procedimiento se introdujo en 1994 [1] y utiliza las herramientas que las levaduras y los bacteriófagos [2] han desarrollado para la replicación eficiente de información genética importante:

Principios generales

Figura 1: Principio de RMCE: el intercambio de casetes genéticos (paso de inversión) es posible mediante una recombinasa (Flp) de la levadura. La parte B muestra mutantes (Fn) del sitio FRT de 48 pb de origen natural (F). Si un casete génico está flanqueado por un conjunto de estos sitios (F y Fn, por ejemplo) puede cambiar de lugar, mediante doble recombinación recíproca, con un segundo casete que forma parte de un plásmido de intercambio (Figura 1, parte A). En la parte C se muestra un experimento modelo, en el que se modifica una celda "vacía" mediante un enfoque de transfección estándar o mediante RMCE. Tenga en cuenta que en el primer caso se afectan múltiples sitios genómicos, cada uno de los cuales genera un nivel de expresión diferente (cf. la amplia distribución de puntos verdes). Si se utiliza una dirección genómica predefinida para introducir el mismo gen informador, cada clon derivado de dicho evento muestra características de expresión comparables.

La mayoría de las cepas de levadura contienen ADN circulares similares a plásmidos llamados "círculos de dos micras". La persistencia de estas entidades está garantizada por una recombinasa llamada "flipase" o "Flp" . Cuatro monómeros de esta enzima se asocian con dos sitios objetivo cortos idénticos (48 pb), llamados FRT ("objetivos de recombinasa invertida"), lo que da como resultado su cruce . El resultado de tal proceso depende de la orientación relativa de los FRT participantes, lo que lleva a

Este espectro de opciones podría ampliarse significativamente mediante la generación de mutantes espaciadores para sitios FRT extendidos de 48 pb (medias flechas cruzadas en la Figura 1). Cada Fn mutante se recombina con un Fn mutante idéntico con una eficiencia igual a los sitios de tipo salvaje (F x F). El diseño particular de estos componentes impide estrictamente una interacción cruzada (F x Fn). Esto prepara el escenario para la situación representada en la Figura 1A:

Aplicado por primera vez para la Tyr-recombinasa Flp, este nuevo procedimiento no solo es relevante para la construcción racional de líneas celulares biotecnológicamente significativas, sino que también encuentra un uso cada vez mayor para la generación sistemática de células madre . Las células madre se pueden utilizar para reemplazar tejido dañado o para generar animales transgénicos con propiedades en gran medida predeterminadas.

RMCE doble

Se ha establecido previamente que la coexpresión de las recombinasas Cre y Flp cataliza el intercambio de secuencias flanqueadas por sitios loxP y FRT únicos integrados en el genoma en una ubicación aleatoria. Sin embargo, estos estudios no exploraron si dicho enfoque podría usarse para modificar alelos condicionales de ratón que portan sitios loxP y FRT únicos o múltiples. El RMCE dual (dRMCE; Osterwalder et al., 2010) se desarrolló recientemente como una herramienta de reingeniería aplicable a la gran cantidad de alelos condicionales de ratón que albergan sitios loxP y FRT de tipo salvaje y, por lo tanto, no son compatibles con el RMCE convencional. La estrategia general dRMCE aprovecha el hecho de que la mayoría de los alelos condicionales codifican un casete de selección flanqueado por sitios FRT, además de sitios loxP que flanquean exones funcionalmente relevantes (exones 'floxed'). El casete de selección flanqueado por FRT generalmente se coloca fuera de la región flanqueada por loxP, lo que hace que estos alelos sean directamente compatibles con dRMCE. La expresión simultánea de las recombinasas Cre y Flp induce la recombinación cis y la formación del alelo eliminado, que luego sirve como un "sitio de acoplamiento" en el que insertar el vector de reemplazo mediante recombinación trans. El locus reemplazado correctamente codificaría la modificación personalizada y un casete de selección de fármaco diferente flanqueado por sitios loxP y FRT únicos. Por lo tanto, dRMCE aparece como una herramienta muy eficaz para la reingeniería específica de miles de alelos de ratón producidos por el consorcio IKMC.

Multiplexación RMCE

Figura 2: Multiplexación RMCE . En el ejemplo dado, se introduce en el genoma un casete de gen indicador (gfp/tk/neo), flanqueado por cuatro sitios FRT heteroespecíficos (F5/F3-F/Fn). La dirección F5/F3 única puede usarse entonces para introducir un elemento regulador ascendente y la dirección F/Fn para aplicar una modificación similar en el extremo descendente. Después de que la expresión del informador gfp haya sido optimizada mediante cambios sistemáticos de este tipo, el casete informador central se puede cambiar por cualquier "gen de interés" (GOI): el GOI estará flanqueado por los sitios F3 y F. , respectivamente y se introducen en consecuencia mientras que los elementos flanqueantes permanecerán en su lugar

Las configuraciones de multiplexación se basan en el hecho de que cada par F-Fn (que consta de un sitio FRT de tipo salvaje y un mutante llamado "n") o cada par Fn-Fm (que consta de dos mutantes, "m" y "n") constituye un único "dirección" en el genoma. Un requisito previo son las diferencias en cuatro de las ocho posiciones de los espaciadores (consulte la Figura 1B). Si la diferencia está por debajo de este umbral, puede producirse alguna interacción cruzada entre los mutantes que conduzca a una eliminación defectuosa de la secuencia entre los sitios heteroespecíficos (Fm/Fn o F/Fn).

Mientras tanto, están disponibles 13 mutantes FRT [3] [4] , que permiten establecer varias direcciones genómicas únicas una al lado de la otra (por ejemplo, F-Fn y Fm-Fo). Estas direcciones serán reconocidas por plásmidos donantes que han sido diseñados según los mismos principios, permitiendo modificaciones sucesivas (pero también sincrónicas) en los loci predeterminados . Estas modificaciones pueden completarse en caso de que los plásmidos donantes compatibles se proporcionen en exceso (principios de acción en masa). La Figura 2 ilustra un uso del principio de multiplexación: la extensión gradual de una región codificante en la que una unidad de expresión básica está provista de aislantes genómicos , potenciadores u otros elementos que actúan en cis .

Una variación reciente del concepto general se basa en PhiC31 (una integrasa de clase Ser) , que permite la introducción de otro objetivo RMCE en un sitio secundario después de que se haya producido la primera modificación basada en RMCE. Esto se debe al hecho de que cada intercambio catalizado por phiC31 destruye los sitios attP y attB que ha abordado [2] convirtiéndolos en sitios de productos att R y att L , respectivamente. Si bien estos cambios permiten el montaje posterior de objetivos nuevos (y muy probablemente remotos), no permiten abordar varios objetivos RMCE en paralelo , ni permiten "RMCE en serie", es decir, modificaciones sucesivas y graduales en un locus genómico determinado.

Esto es diferente para Flp-RMCE, para el cual el estado post-RMCE de los FRT corresponde a su estado inicial. Esta propiedad permite la movilización intencional y repetida de un casete objetivo mediante la adición de un nuevo plásmido donante con arquitectura compatible. Estas opciones de "multiplexación-RMCE" abren posibilidades ilimitadas para modificaciones específicas en serie y en paralelo de objetivos RMCE predeterminados [5]

Aplicaciones

Generación de animales transgénicos

Generación de ratones transgénicos knock-out/-in y su modificación genética mediante RMCE. [6] [7]

Marcado e intercambio de casetes en células DG44 en cultivo en suspensión.

Inserción de un casete diana en una línea celular huésped de mamífero (CHO DG44 en cultivo en suspensión) e intercambio con una construcción indicadora de estrés del RE mediante integración dirigida (RMCE). [8]

Ver también

Referencias

  1. ^ Schlake, T., Bode, J. (1994). "Uso de sitios objetivo de reconocimiento de Flp ( FRT -) mutados para el intercambio de casetes de expresión en loci cromosómicos definidos ". Bioquímica . 33 (43): 12746–12751. doi :10.1021/bi00209a003. PMID  7947678.{{cite journal}}: Mantenimiento CS1: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  2. ^ ab Bateman, Jack R; Anne M. Lee; C.-ting Wu (junio de 2006). "Transformación de sitio específico de Drosophila mediante intercambio de casetes mediado por phiC31-Integrase". Genética . 173 (2): 769–777. doi :10.1534/genética.106.056945. PMC 1526508 . PMID  16547094. 
  3. ^ Predicar, J; T. Schlake; M. Iber; D. Schübeler; J. Seibler; E. Snezhkov; L. Nikolaev (2000). "La caja de herramientas del transgenetista: métodos novedosos para la modificación dirigida de genomas eucarióticos". Biol. química . 381 (9–10): 801–813. doi :10.1515/BC.2000.103. PMID  11076013.
  4. ^ Turán, S.; Kuehle, J.; Schambach, A.; Baum, C.; Bode, J. (2010). "Multiplexación de RMCE: extensiones versátiles de la tecnología de intercambio de casetes mediada por recombinasa Flp". J. Mol. Biol . 402 (1): 52–69. doi :10.1016/j.jmb.2010.07.015. PMID  20650281.
  5. ^ Turán, S; J. Bode (2011). "Recombinasas específicas de sitio: desde modificaciones genómicas basadas en etiquetas y objetivos a etiquetas e intercambio". FASEB J. 25 (12): 4088–4107. doi : 10.1096/fj.11-186940 . PMID  21891781.
  6. ^ Cesari F, Rennekampff V, Vintersten K, Vuong LG, Seibler J, Bode J, Wiebel FF, Nordheim A (febrero de 2004). "Ratones knock-out Elk-1 diseñados mediante intercambio de casetes mediado por recombinasa Flp". Génesis . 38 (2): 87–92. doi :10.1002/gene.20003. PMID  14994271.
  7. ^ Roebroek AJ, Reekmans S, Lauwers A, Feyaerts N, Smeijers L, Hartmann D (enero de 2006). "Los ratones mutantes Lrp1 knock-in generados mediante intercambio de casetes mediado por recombinasa revelan una importancia diferencial de los motivos NPXY en el dominio intracelular de LRP1 para el desarrollo fetal normal". Biol celular mol . 26 (2): 605–16. doi :10.1128/MCB.26.2.605-616.2006. PMC 1346909 . PMID  16382151. 
  8. ^ Kober L, Zehe C, Bode J (octubre de 2012). "Desarrollo de un novedoso sistema de selección basado en estrés ER para el aislamiento de clones altamente productivos". Biotecnología. Bioeng . 109 (10): 2599–611. doi : 10.1002/bit.24527. PMID  22510960.

enlaces externos