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Complejo silenciador inducido por ARN

El complejo de silenciamiento inducido por ARN , o RISC , es un complejo multiproteico , específicamente una ribonucleoproteína , que funciona en el silenciamiento génico a través de una variedad de vías a nivel transcripcional y traduccional. [1] Utilizando fragmentos de ARN monocatenario (ssRNA), como microARN (miRNA), o ARN interferente pequeño bicatenario (siRNA), el complejo funciona como una herramienta clave en la regulación génica. [2] La hebra simple de ARN actúa como una plantilla para que RISC reconozca la transcripción de ARN mensajero complementario (ARNm) . Una vez encontrada, una de las proteínas en RISC, Argonaute , activa y escinde el ARNm. Este proceso se llama interferencia de ARN (RNAi) y se encuentra en muchos eucariotas ; es un proceso clave en la defensa contra infecciones virales , ya que se desencadena por la presencia de ARN bicatenario (dsRNA). [3] [4] [1]

Descubrimiento

La identificación bioquímica de RISC fue realizada por Gregory Hannon y sus colegas en el Laboratorio Cold Spring Harbor . [5] Esto fue sólo un par de años después del descubrimiento de la interferencia de ARN en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello , quienes compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006. [3 ]

Drosophila melanogaster

Hannon y sus colegas intentaron identificar los mecanismos de RNAi involucrados en el silenciamiento génico , por dsRNAs, en células de Drosophila . Las células S2 de Drosophila fueron transfectadas con un vector de expresión lacZ para cuantificar la expresión génica con actividad de β-galactosidasa . Sus resultados mostraron que la cotransfección con dsRNA lacZ redujo significativamente la actividad de β-galactosidasa en comparación con el dsRNA de control. Por lo tanto, los dsRNA controlan la expresión génica a través de la complementariedad de secuencias .

Las células S2 se transfectaron con el ARN de doble cadena de ciclina E de Drosophila . La ciclina E es un gen esencial para la progresión del ciclo celular hacia la fase S. El ARN de doble cadena de ciclina E detuvo el ciclo celular en la fase G1 (antes de la fase S). Por lo tanto, el ARNi puede dirigirse a genes endógenos .

Además, el dsRNA de ciclina E solo disminuyó el ARN de ciclina E; también se demostró un resultado similar utilizando dsRNA correspondiente a la ciclina A que actúa en las fases S, G 2 y M del ciclo celular. Esto muestra el sello característico del RNAi: los niveles reducidos de ARNm corresponden a los niveles de dsRNA agregados.

Para probar si su observación de niveles disminuidos de ARNm era el resultado de que el ARNm fuera atacado directamente (como lo sugerían los datos de otros sistemas), las células S2 de Drosophila se transfectaron con dsRNA de ciclina E de Drosophila o dsRNA de lacZ y luego se incubaron con ARNm sintéticos para ciclina E o lacZ .

Las células transfectadas con dsRNA de ciclina E solo mostraron degradación en las transcripciones de ciclina E; las transcripciones de lacZ fueron estables. Por el contrario, las células transfectadas con dsRNA de lacZ solo mostraron degradación en las transcripciones de lacZ y no en las transcripciones de ciclina E. Sus resultados llevaron a Hannon y sus colegas a sugerir que el RNAi degrada el ARNm objetivo a través de una " actividad nucleasa específica de secuencia ". Llamaron a la enzima nucleasa RISC. [5] Más tarde, Devanand Sarkar y sus colegas Prasanna K. Santhekadur y Byoung Kwon Yoo en la Universidad Commonwealth de Virginia dilucidaron la actividad RISC y su mecanismo molecular en las células cancerosas e identificaron otro nuevo componente del RISC, llamado AEG-1 [47].

Función en la interferencia del ARN

El dominio PIWI de una proteína Argonauta en complejo con ARN bicatenario.

Incorporación de siRNA/miRNA

El Dicer de la ARNasa III es un miembro fundamental de RISC que inicia el proceso de interferencia del ARN mediante la producción de ARNi de doble cadena o miARN de cadena sencilla. La escisión enzimática del ARNbc dentro de la célula produce fragmentos cortos de ARNi de 21 a 23 nucleótidos de longitud con un saliente 3' de dos nucleótidos . [6] [7] Dicer también procesa el pre-miARN, que forma una estructura de bucle de horquilla para imitar al ARNbc, de manera similar. Los fragmentos de ARNbc se cargan en RISC y cada cadena tiene un destino diferente según el fenómeno de la regla de asimetría, la selección de una cadena como cadena guía sobre la otra según la estabilidad termodinámica. [8] [9] [10] [11] El miARN o el ARNi recién generados actúan como secuencias guía de cadena sencilla para que RISC dirija el ARNm para su degradación. [12] [13]

Parte de la vía de interferencia de ARN con las diferentes formas en que RISC puede silenciar genes a través de su ARN mensajero.

Regulación genética

AGO2 (gris) en complejo con un microARN (azul claro) y su ARNm diana (azul oscuro)

Las principales proteínas de RISC, Ago2, SND1 y AEG-1, actúan como contribuyentes cruciales a la función de silenciamiento genético del complejo. [16]

RISC utiliza la cadena guía de miRNA o siRNA para apuntar a regiones complementarias 3' no traducidas (3'UTR) de transcripciones de ARNm a través del apareamiento de bases Watson-Crick , lo que le permite regular la expresión genética de la transcripción de ARNm de varias maneras. [17] [1]

degradación del ARNm

La función más conocida de RISC es la degradación del ARNm objetivo, lo que reduce los niveles de transcripción disponibles para ser traducidos por los ribosomas . La escisión endonucleolítica del ARNm complementario a la cadena guía de RISC por la proteína Argonaute es la clave para la iniciación de la interferencia de ARN. [18] Hay dos requisitos principales para que se produzca la degradación del ARNm:

Existen dos vías principales de degradación del ARNm una vez que se ha producido la escisión. Ambas se inician mediante la degradación de la cola poli(A) del ARNm , lo que da como resultado la eliminación de la tapa 5' del ARNm.

Represión traduccional

El RISC puede modular la carga de ribosoma y factores accesorios en la traducción para reprimir la expresión de la transcripción de ARNm unida. La represión de la traducción solo requiere una coincidencia parcial de la secuencia entre la cadena guía y el ARNm objetivo. [1]

La traducción se puede regular en la etapa inicial mediante:

La traducción se puede regular en pasos posteriores a la iniciación mediante:

Todavía se especula sobre si la represión traduccional a través de la iniciación y la postiniciación es mutuamente excluyente.

Formación de heterocromatina

Algunos RISC pueden dirigirse directamente al genoma reclutando metiltransferasas de histonas para formar heterocromatina en el locus del gen , silenciando el gen. Estos RISC toman la forma de un complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS). El ejemplo mejor estudiado es el de los RITS de levadura . [1] [23] [24]

Se ha demostrado que RITS dirige la formación de heterocromatina en los centrómeros a través del reconocimiento de repeticiones centroméricas. Mediante el apareamiento de bases de ARNi (cadena guía) con secuencias de cromatina objetivo, se pueden reclutar enzimas modificadoras de histonas. [25]

El mecanismo no se entiende bien; sin embargo, los RITS degradan las transcripciones nacientes de ARNm. Se ha sugerido que este mecanismo actúa como un " ciclo de retroalimentación que se refuerza a sí mismo ", ya que las transcripciones nacientes degradadas son utilizadas por la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) para generar más ARNi. [26]

En Schizosaccharomyces pombe y Arabidopsis , el procesamiento de los ARN de doble cadena en ARNi por las ARNasas Dicer puede iniciar una vía de silenciamiento génico mediante la formación de heterocromatina. Una proteína Argonaute conocida como AGO4 interactúa con los ARN pequeños que definen secuencias heterocromáticas. Una histona metil transferasa (HMT), H3K9 , metila la histona H3 y recluta proteínas de cromodominio a los sitios de metilación. La metilación del ADN mantiene el silenciamiento de los genes a medida que las secuencias de heterocromatina pueden establecerse o propagarse. [27]

Eliminación de ADN

El ARNi generado por los RISC parece tener un papel en la degradación del ADN durante el desarrollo del macronúcleo somático en los ciliados del género Tetrahymena . Es similar al control epigenético de la formación de la heterocromatina y se lo considera una defensa contra elementos genéticos invasores. [27]

De manera similar a la formación de heterocromatina en S. pombe y Arabidopsis , una proteína de Tetrahymena  relacionada con la familia Argonaute, Twi1p, cataliza la eliminación del ADN de secuencias diana conocidas como secuencias de eliminación interna (IES). Mediante el uso de metiltransferasas y proteínas de cromodominio, las IES se heterocromatizan y se eliminan del ADN. [27]

Proteínas asociadas a RISC

La estructura completa de RISC aún no se ha resuelto. Muchos estudios han informado sobre una variedad de tamaños y componentes para RISC, pero no se sabe con certeza si esto se debe a que existen varios complejos RISC o a las diferentes fuentes que utilizan los distintos estudios. [28]

Ago, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, ortólogo de D. melanogaster de la p68 ARN desenrollasa de mamíferos; eIF2C1, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C1; eIF2C2, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C2; Fmr1/Fxr, ortólogo de D. melanogaster de la proteína de retraso mental del cromosoma X frágil; miRNP, complejo miRNA-proteína; NR, no informado; Tsn, nucleasa estafilocócica-Tudor; Vig, gen intrónico vasa.

Una proteína argonauta de longitud completa de la especie de arquea Pyrococcus furiosus .

De todas formas, es evidente que las proteínas Argonaute están presentes y son esenciales para la función. Además, se han obtenido datos sobre algunas de las proteínas clave (además de Argonaute) dentro del complejo, que permiten que RISC lleve a cabo su función.

Proteínas argonautas

Las proteínas Argonautas son una familia de proteínas que se encuentran en procariotas y eucariotas. Su función en procariotas es desconocida, pero en eucariotas son responsables de la interferencia del ARN. [43] Hay ocho miembros de la familia en los Argonautas humanos, de los cuales solo Argonauta 2 está involucrado exclusivamente en la escisión dirigida del ARN en RISC. [40]

El complejo de carga RISC permite cargar fragmentos de dsRNA (generados por Dicer) en Argonaute 2 (con la ayuda de TRBP) como parte de la vía de interferencia de ARN.

Complejo de carga RISC

El complejo de carga RISC (RLC) es la estructura esencial necesaria para cargar fragmentos de ARN bicatenario en el RISC con el fin de dirigirse al ARNm. El RLC está formado por Dicer, la proteína de unión al ARN de respuesta transactivadora ( TRBP ) y Argonaute 2.

Dicer se asocia con TRBP y Argonaute 2 para facilitar la transferencia de los fragmentos de dsRNA generados por Dicer a Argonaute 2. [44] [45]

Investigaciones más recientes han demostrado que la helicasa A de ARN humana podría ayudar a facilitar la RLC. [46]

Otras proteínas

Los miembros recientemente identificados de RISC son SND1 y MTDH . [47] SND1 y MTDH son oncogenes y regulan la expresión de varios genes. [48]

Ago, Argonaute; Dcr, Dicer; Dmp68, ortólogo de D. melanogaster de la p68 ARN desenrollasa de mamíferos; eIF2C1, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C1; eIF2C2, factor de iniciación de la traducción eucariota 2C2; Fmr1/Fxr, ortólogo de D. melanogaster de la proteína de retraso mental del cromosoma X frágil; Tsn, nucleasa estafilocócica de Tudor; Vig, gen intrónico de los vasos.

Unión del ARNm

Diagrama de la actividad RISC con miRNAs

Todavía no está claro cómo el complejo RISC activado localiza los objetivos del ARNm en la célula, aunque se ha demostrado que el proceso puede ocurrir en situaciones fuera de la traducción de proteínas en curso del ARNm. [50]

Los miRNA expresados ​​endógenamente en metazoos no suelen ser perfectamente complementarios a una gran cantidad de genes y, por lo tanto, modulan la expresión a través de la represión traduccional. [51] [52] Sin embargo, en plantas , el proceso tiene una especificidad mucho mayor para el ARNm diana y, por lo general, cada miRNA solo se une a un ARNm. Una mayor especificidad significa que es más probable que se produzca la degradación del ARNm. [53]

Véase también

Referencias

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