Los marcadores de ADN asociado a sitios de restricción (RAD) son un tipo de marcador genético que son útiles para mapeo de asociaciones, mapeo de QTL , genética de poblaciones , genética ecológica y genética evolutiva. El uso de marcadores RAD para el mapeo genético a menudo se denomina mapeo RAD. Un aspecto importante de los marcadores y el mapeo RAD es el proceso de aislamiento de etiquetas RAD, que son las secuencias de ADN que flanquean inmediatamente cada instancia de un sitio de restricción particular de una enzima de restricción en todo el genoma. [1] Una vez que se han aislado las etiquetas RAD, se pueden utilizar para identificar y genotipar polimorfismos de secuencia de ADN principalmente en forma de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) . [1] Los polimorfismos que se identifican y genotipifican mediante el aislamiento y el análisis de etiquetas RAD se denominan marcadores RAD. Aunque el genotipado mediante secuenciación presenta un enfoque similar al método RAD-seq, difieren en algunos aspectos sustanciales. [2] [3] [4]
El uso de secuencias de ADN flanqueantes alrededor de cada sitio de restricción es un aspecto importante de las etiquetas RAD. [1] La densidad de etiquetas RAD en un genoma depende de la enzima de restricción utilizada durante el proceso de aislamiento. [5] Existen otras técnicas de marcadores de sitios de restricción, como RFLP o polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), que utilizan polimorfismo de longitud de fragmentos causado por diferentes sitios de restricción, para la distinción del polimorfismo genético. El uso de secuencias de ADN flanqueantes en técnicas de etiquetas RAD se denomina método de representación reducida. [2]
El procedimiento inicial para aislar etiquetas RAD implicó digerir el ADN con una enzima de restricción particular, ligar adaptadores biotinilados a los salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre los sitios de restricción y aislar los fragmentos biotinilados usando perlas de estreptavidina . [1] Este procedimiento se utilizó inicialmente para aislar etiquetas RAD para análisis de microarrays . [1] [6] [7] Más recientemente, el procedimiento de aislamiento de etiquetas RAD se modificó para su uso con secuenciación de alto rendimiento en la plataforma Illumina , lo que tiene el beneficio de tasas de error sin procesar muy reducidas y un alto rendimiento. [5] El nuevo procedimiento implica digerir el ADN con una enzima de restricción particular (por ejemplo: SbfI, NsiI,…), ligar el primer adaptador, llamado P1, a los salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre sitios de restricción, preparando los extremos cortados en extremos romos y ligando el segundo adaptador (P2), y usando PCR para amplificar específicamente fragmentos que contienen ambos adaptadores. Es importante destacar que el primer adaptador contiene un código de barras de secuencia de ADN corto, llamado MID (identificador molecular) que se utiliza como marcador para identificar diferentes muestras de ADN que se combinan y secuencian en la misma reacción. [5] [8] El uso de secuenciación de alto rendimiento para analizar etiquetas RAD se puede clasificar como secuenciación de representación reducida, que incluye, entre otras cosas, RADSeq (RAD-Sequencing). [2]
Una vez que se han aislado las etiquetas RAD, se pueden utilizar para identificar y genotipar polimorfismos de secuencia de ADN, como los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [1] [5] Estos sitios polimórficos se denominan marcadores RAD. La forma más eficaz de encontrar etiquetas RAD es mediante la secuenciación de ADN de alto rendimiento , [5] [8] llamada secuenciación de etiquetas RAD, secuenciación RAD, RAD-Seq o RADSeq.
Antes del desarrollo de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los marcadores RAD se identificaban hibridando etiquetas RAD con microarrays. [1] [6] [7] Debido a la baja sensibilidad de los microarrays, este enfoque solo puede detectar polimorfismos de secuencia de ADN que interrumpen los sitios de restricción y conducen a la ausencia de etiquetas RAD o polimorfismos sustanciales de secuencia de ADN que interrumpen la hibridación de etiquetas RAD. Por lo tanto, la densidad de marcadores genéticos que se puede lograr con microarrays es mucho menor que la que es posible con la secuenciación de ADN de alto rendimiento. [9]
Los marcadores RAD se implementaron por primera vez mediante microarrays y luego se adaptaron para NGS (Next-Generation-Sequencing). [9] Fue desarrollado conjuntamente por los laboratorios de Eric Johnson y William Cresko en la Universidad de Oregon alrededor de 2006. Confirmaron la utilidad de los marcadores RAD al identificar puntos de ruptura de recombinación en D. melanogaster y al detectar QTL en espinosos de tres espinas. [1]
En 2012, se sugirió un método de etiquetado RAD modificado llamado RADseq de doble digestión (ddRADseq). [10] [11] Al agregar una segunda enzima de restricción, reemplazar el corte aleatorio y un paso estricto de selección del tamaño del ADN, es posible realizar un genotipado de población de bajo costo. Esta puede ser una herramienta especialmente poderosa para escaneos de genoma completo para selección y diferenciación de poblaciones o adaptación de poblaciones. [11]
Un estudio de 2016 presentó un método novedoso llamado hibridación RAD (hyRAD), [12] en el que fragmentos de RAD biotinilados , que cubren una fracción aleatoria del genoma, se utilizan como cebos para capturar fragmentos homólogos de bibliotecas de secuenciación de escopeta genómica . Los fragmentos de ADN se generan primero mediante el protocolo ddRADseq aplicado a muestras frescas y se utilizan como sondas de captura de hibridación para enriquecer bibliotecas de escopeta en los fragmentos de interés. Este enfoque simple y rentable permite la secuenciación de loci ortólogos incluso a partir de muestras de ADN altamente degradadas, abriendo nuevas vías de investigación en el campo de la museística . Otra ventaja del método es que no depende de la presencia del sitio de restricción , lo que mejora la cobertura de loci entre muestras. La técnica se probó por primera vez en muestras frescas y de museo de Oedaleus decorus , una especie de saltamontes paleártico , y luego se implementó en mieleros regentes , [13] artrópodos , [14] entre otras especies. Se desarrolló un protocolo de laboratorio para implementar hyRAD en aves. [15]