La precipitación de proteínas se utiliza ampliamente en el procesamiento posterior de productos biológicos para concentrar proteínas y purificarlas de diversos contaminantes. Por ejemplo, en la industria biotecnológica se utiliza la precipitación de proteínas para eliminar contaminantes comúnmente contenidos en la sangre. [1] El mecanismo subyacente de la precipitación es alterar el potencial de solvatación del disolvente, más específicamente, reduciendo la solubilidad del soluto mediante la adición de un reactivo.
La solubilidad de las proteínas en tampones acuosos depende de la distribución de los residuos de aminoácidos hidrófilos e hidrófobos en la superficie de la proteína. Los residuos hidrofóbicos se encuentran predominantemente en el núcleo proteico globular, pero algunos existen en parches en la superficie. Las proteínas que tienen un alto contenido de aminoácidos hidrófobos en la superficie tienen baja solubilidad en un disolvente acuoso. Los residuos superficiales cargados y polares interactúan con grupos iónicos en el disolvente y aumentan la solubilidad de una proteína. El conocimiento de la composición de aminoácidos de una proteína ayudará a determinar el disolvente y los métodos de precipitación ideales.
Las fuerzas electrostáticas de repulsión se forman cuando las proteínas se disuelven en una solución electrolítica . Estas fuerzas repulsivas entre proteínas previenen la agregación y facilitan la disolución. Tras la disolución en una solución de electrolitos, los contraiones del disolvente migran hacia residuos superficiales cargados en la proteína, formando una matriz rígida de contraiones en la superficie de la proteína. Junto a esta capa hay otra capa de solvatación que es menos rígida y, a medida que uno se aleja de la superficie de la proteína, contiene una concentración decreciente de contraiones y una concentración creciente de coiones. La presencia de estas capas de solvatación hace que la proteína tenga menos interacciones iónicas con otras proteínas y disminuye la probabilidad de agregación. También se forman fuerzas electrostáticas de repulsión cuando las proteínas se disuelven en agua. El agua forma una capa de solvatación alrededor de los residuos superficiales hidrófilos de una proteína. El agua establece un gradiente de concentración alrededor de la proteína, con la mayor concentración en la superficie de la proteína. Esta red de agua tiene un efecto amortiguador sobre las fuerzas de atracción entre proteínas.
Existen fuerzas dispersivas o de atracción entre proteínas a través de dipolos permanentes e inducidos . Por ejemplo, los residuos básicos de una proteína pueden tener interacciones electrostáticas con residuos ácidos de otra proteína. Sin embargo, la solvatación por iones en una solución electrolítica o agua disminuirá las fuerzas de atracción proteína-proteína. Por lo tanto, para precipitar o inducir la acumulación de proteínas, se debe reducir la capa de hidratación alrededor de la proteína. El propósito de los reactivos agregados en la precipitación de proteínas es reducir la capa de hidratación.
La formación de precipitados de proteínas se produce en un proceso gradual. Primero, se añade un agente precipitante y la solución se mezcla constantemente. La mezcla hace que el precipitante y la proteína colisionen. Se requiere suficiente tiempo de mezcla para que las moléculas se difundan a través de los remolinos de fluido. A continuación, las proteínas pasan por una fase de nucleación , donde se generan agregados o partículas de proteínas de tamaño submicroscópico. El crecimiento de estas partículas está bajo control de difusión browniana. Una vez que las partículas alcanzan un tamaño crítico (0,1 µm a 10 µm para campos de alto y bajo cizallamiento , respectivamente), mediante la adición difusiva de moléculas de proteína individuales, continúan creciendo colisionando entre sí y pegándose o floculando . Esta fase ocurre a un ritmo más lento. Durante el paso final, llamado envejecimiento en un campo de cizallamiento, las partículas del precipitado chocan y se pegan repetidamente, luego se rompen, hasta que se alcanza un tamaño medio de partícula estable, que depende de las proteínas individuales. La resistencia mecánica de las partículas de proteína se correlaciona con el producto de la velocidad de corte media y el tiempo de envejecimiento, que se conoce como número de Camp. El envejecimiento ayuda a que las partículas resistan las fuerzas de corte del fluido que se encuentran en las bombas y las zonas de alimentación de las centrífugas sin reducir su tamaño.
La salazón es el método más común utilizado para precipitar una proteína. La adición de una sal neutra, como el sulfato de amonio , comprime la capa de solvatación y aumenta las interacciones proteína-proteína. A medida que aumenta la concentración de sal de una solución, las cargas en la superficie de la proteína interactúan con la sal, no con el agua, exponiendo así parches hidrofóbicos en la superficie de la proteína y provocando que la proteína se caiga de la solución (agregada y precipitada).
La salazón es un proceso espontáneo cuando se alcanza la concentración adecuada de sal en solución. Las manchas hidrofóbicas en la superficie de la proteína generan capas de agua altamente ordenadas. Esto da como resultado una pequeña disminución de la entalpía , Δ H , y una disminución mayor de la entropía , Δ S, de las moléculas de agua ordenadas en relación con las moléculas de la solución en masa. El cambio total de energía libre , Δ G , del proceso viene dado por la ecuación de energía libre de Gibbs:
Δ G = cambio de energía libre, Δ H = cambio de entalpía tras la precipitación, Δ S = cambio de entropía tras la precipitación, T = temperatura absoluta. Cuando las moléculas de agua en la capa de solvatación rígida regresan a la fase masiva a través de interacciones con la sal agregada, su mayor libertad de movimiento provoca un aumento significativo de su entropía. Por tanto, Δ G se vuelve negativo y la precipitación se produce de forma espontánea.
Los cosmotropos o "estabilizadores de la estructura del agua" son sales que favorecen la disipación/dispersión del agua desde la capa de solvatación alrededor de una proteína. Luego, los parches hidrofóbicos quedan expuestos en la superficie de la proteína e interactúan con parches hidrofóbicos de otras proteínas. Estas sales mejoran la agregación y precipitación de proteínas. Los caotropos o "rompedores de la estructura del agua" tienen el efecto opuesto al de los kosmotropos. Estas sales promueven un aumento de la capa de solvatación alrededor de una proteína. La eficacia de las sales cosmotrópicas en la precipitación de proteínas sigue el orden de la serie de Hofmeister:
Mayor precipitación Menor precipitación
Mayor precipitación Menor precipitación
La disminución de la solubilidad de las proteínas sigue una curva de solubilidad normalizada del tipo mostrado. La relación entre la solubilidad de una proteína y el aumento de la fuerza iónica de la solución se puede representar mediante la ecuación de Cohn :
S = solubilidad de la proteína, B es la solubilidad idealizada, K es una constante específica de la sal e I es la fuerza iónica de la solución, que se atribuye a la sal agregada.
z i es la carga iónica de la sal y ci es la concentración de sal. La sal ideal para la precipitación de proteínas es más eficaz para una composición de aminoácidos particular, económica, no amortiguadora y no contaminante. La sal más utilizada es el sulfato de amonio . Hay una baja variación en la salinización a temperaturas de 0 °C a 30 °C. Los precipitados de proteínas que quedan en la solución salina pueden permanecer estables durante años, protegidos de la proteólisis y la contaminación bacteriana por las altas concentraciones de sal.
El punto isoeléctrico (pI) es el pH de una solución en el que la carga primaria neta de una proteína se vuelve cero. A un pH de la solución que está por encima del pI, la superficie de la proteína está predominantemente cargada negativamente y, por lo tanto, las moléculas con carga similar exhibirán fuerzas repulsivas. Asimismo, a un pH de solución inferior al pI, la superficie de la proteína está predominantemente cargada positivamente y se produce repulsión entre proteínas. Sin embargo, en el pI las cargas negativas y positivas se cancelan, las fuerzas electrostáticas de repulsión se reducen y predominan las fuerzas de atracción. Las fuerzas de atracción provocarán agregación y precipitación. El pI de la mayoría de las proteínas está en el rango de pH de 4 a 6. Como precipitantes se utilizan ácidos minerales, como el ácido clorhídrico y el ácido sulfúrico . La mayor desventaja de la precipitación en el punto isoeléctrico es la desnaturalización irreversible causada por los ácidos minerales. Por esta razón, la precipitación en puntos isoeléctricos se utiliza con mayor frecuencia para precipitar proteínas contaminantes, en lugar de la proteína objetivo. La precipitación de caseína durante la elaboración del queso o durante la producción de caseinato de sodio es una precipitación isoeléctrica.
La adición de disolventes miscibles como etanol o metanol a una solución puede provocar que las proteínas de la solución precipiten. La capa de solvatación alrededor de la proteína disminuirá a medida que el solvente orgánico desplaza progresivamente el agua de la superficie de la proteína y la une en capas de hidratación alrededor de las moléculas del solvente orgánico. Con capas de hidratación más pequeñas, las proteínas pueden agregarse mediante fuerzas electrostáticas y dipolares de atracción. Los parámetros importantes a considerar son la temperatura, que debe ser inferior a 0 °C para evitar la desnaturalización , el pH y la concentración de proteínas en la solución. Los disolventes orgánicos miscibles disminuyen la constante dieléctrica del agua, lo que de hecho permite que dos proteínas se acerquen. En el punto isoeléctrico la relación entre la constante dieléctrica y la solubilidad de las proteínas viene dada por:
S 0 es un valor extrapolado de S , e es la constante dieléctrica de la mezcla y k es una constante que se relaciona con la constante dieléctrica del agua. El proceso de Cohn para el fraccionamiento de proteínas plasmáticas se basa en la precipitación con disolvente con etanol para aislar proteínas plasmáticas individuales.
Una aplicación clínica para el uso de metanol como agente precipitante de proteínas es la estimación de la bilirrubina.
Los polímeros , como los dextranos y los polietilenglicoles , se utilizan con frecuencia para precipitar proteínas porque tienen baja inflamabilidad y es menos probable que desnaturalicen los biomateriales que la precipitación isoeléctrica. Estos polímeros en solución atraen las moléculas de agua lejos de la capa de solvatación alrededor de la proteína. Esto aumenta las interacciones proteína-proteína y mejora la precipitación. Para el caso específico del polietilenglicol, la precipitación se puede modelar mediante la ecuación:
C es la concentración de polímero, P es un coeficiente de interacción proteína-proteína, a es un coeficiente de interacción proteína-polímero y
μ es el potencial químico del componente I, R es la constante universal de los gases y T es la temperatura absoluta.
El alginato , la carboximetilcelulosa, el ácido poliacrílico, el ácido tánico y los polifosfatos pueden formar redes extendidas entre las moléculas de proteínas en solución. La eficacia de estos polielectrolitos depende del pH de la solución. Los polielectrolitos aniónicos se utilizan a valores de pH inferiores al punto isoeléctrico. Los polielectrolitos catiónicos se encuentran en valores de pH superiores al pI. Es importante tener en cuenta que un exceso de polielectrolitos hará que el precipitado se disuelva nuevamente en la solución. Un ejemplo de floculación de polielectrolitos es la eliminación de la nube de proteínas del mosto de cerveza utilizando musgo irlandés .
Las sales metálicas se pueden utilizar en bajas concentraciones para precipitar enzimas y ácidos nucleicos de soluciones. Los iones metálicos polivalentes utilizados frecuentemente son Ca 2+ , Mg 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ .
Existen numerosos reactores a escala industrial que se pueden utilizar para precipitar grandes cantidades de proteínas, como las ADN polimerasas recombinantes a partir de una solución.[1]
Los reactores discontinuos son el tipo más simple de reactor de precipitación. El agente precipitante se añade lentamente a la solución de proteína mientras se mezcla. Las partículas de proteína que se agregan tienden a ser compactas y de forma regular. Dado que las partículas están expuestas a una amplia gama de esfuerzos cortantes durante un largo período de tiempo, tienden a ser compactas, densas y mecánicamente estables.
En los reactores tubulares, la solución de proteína de alimentación y el reactivo de precipitación se ponen en contacto en una zona de mezcla eficiente y luego se introducen en tubos largos donde tiene lugar la precipitación. El fluido en los elementos volumétricos se acerca al flujo pistón a medida que se mueven a través de los tubos del reactor. El flujo turbulento se promueve mediante inserciones de malla de alambre en el tubo. El reactor tubular no requiere piezas mecánicas móviles y su construcción es económica. Sin embargo, el reactor puede volverse imprácticamente largo si las partículas se agregan lentamente.
Los reactores CSTR funcionan en estado estacionario con un flujo continuo de reactivos y productos en un tanque bien mezclado. La alimentación de proteína fresca entra en contacto con la suspensión que ya contiene partículas de precipitado y los reactivos de precipitación.
