El proceso de Cohn , desarrollado por Edwin J. Cohn , consiste en una serie de pasos de purificación con el fin de extraer albúmina del plasma sanguíneo . El proceso se basa en la solubilidad diferencial de la albúmina y otras proteínas plasmáticas en función del pH , la concentración de etanol , la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de proteínas. [1] [2] La albúmina tiene la mayor solubilidad y el punto isoeléctrico más bajo de todas las principales proteínas plasmáticas. Esto lo convierte en el producto final que se precipitará o se separará de su solución en forma sólida. La albúmina fue un excelente sustituto del plasma humano en la Segunda Guerra Mundial. Cuando se administró a soldados heridos u otros pacientes con pérdida de sangre, ayudó a ampliar el volumen de sangre y condujo a una recuperación más rápida. El método de Cohn fue lo suficientemente suave como para que la proteína albúmina aislada conservara su actividad biológica . [3]
Durante las operaciones, la concentración de etanol cambia de cero inicialmente al 40%. El pH disminuye de neutro en 7 a más ácido en 4,8 durante el transcurso del fraccionamiento. La temperatura comienza a temperatura ambiente y disminuye a -5 grados Celsius. Inicialmente, la sangre se congela. Hay cinco fracciones principales. Cada fracción termina con un precipitado específico. Estos precipitados son fracciones separadas. [4]
Las fracciones I, II y III precipitan en etapas anteriores. Las condiciones de las etapas anteriores son 8% de etanol, pH 7,2, -3 °C y 5,1% de proteína para la Fracción I; 25% de etanol, pH de 6,9, −5 °C y 3% de proteína. La albúmina permanece en la fracción sobrenadante durante la separación sólido/líquido en estas condiciones. La fracción IV tiene varias proteínas no deseadas que deben eliminarse. Para ello, se varían las condiciones para precipitar las proteínas. Las condiciones para precipitar estas proteínas son elevar la concentración de etanol del 18 al 40% y elevar el pH de 5,2 a 5,8. Finalmente, la albúmina se ubica en la fracción V. La precipitación de la albúmina se realiza reduciendo el pH a 4,8, que está cerca del pI de la proteína, y manteniendo la concentración de etanol en un 40%, con una concentración de proteína del 1%. Por tanto, en la quinta fracción sólo queda el 1% del plasma original. [4]
Sin embargo, la albúmina se pierde en cada etapa del proceso, y aproximadamente el 20% de la albúmina se pierde en las etapas de precipitación antes de la fracción V. Para purificar la albúmina, se extrae con agua y se ajusta a etanol al 10%, pH de 4,5 a -3 ºC. Cualquier precipitado que se forme aquí se produce por filtración y es una impureza. Estos precipitados se descartan. La reprecipitación, o repetición del paso de precipitación para mejorar la pureza, se realiza elevando la concentración de etanol al 40% desde la etapa de extracción. El pH es 5,2 y se realiza a -5 °C. Se crearon varias variaciones de la fracción de Cohn para tener en cuenta un menor costo y un mayor rendimiento. Generalmente, si el rendimiento es alto, la pureza se reduce a aproximadamente 85-90%. [4]
Cohn pudo iniciar el Laboratorio de fraccionamiento de plasma después de que las agencias gubernamentales y las compañías farmacéuticas privadas le otorgaran una financiación masiva. Esto llevó al fraccionamiento del plasma humano. El plasma humano demostró tener varios componentes útiles además de la albúmina. El fraccionamiento del plasma sanguíneo humano produjo albúmina sérica humana , gammaglobulina sérica , fibrinógeno , trombina y globulinas del grupo sanguíneo. [5] Las fracciones de fibrinógeno y trombina se combinaron aún más durante la guerra en productos adicionales, incluido un sellador de fibrina líquida , [6] espuma de fibrina sólida y una película de fibrina. [7] Las gammaglobulinas se encuentran en las fracciones II y III y demostraron ser esenciales en el tratamiento del sarampión en los soldados. La gammaglobulina también fue útil en el tratamiento de la polio, pero no tuvo mucho efecto en el tratamiento de las paperas o la escarlatina. Lo más importante es que las gammaglobulinas fueron útiles para modificar y prevenir la hepatitis infecciosa durante la Segunda Guerra Mundial. Con el tiempo se convirtió en un tratamiento para niños expuestos a este tipo de hepatitis. [5]
Se utilizó sellador de fibrina líquida para tratar a las víctimas de quemaduras, incluidas algunas del ataque a Pearl Harbor, para colocar injertos de piel con una mayor tasa de éxito. [6] También resultó útil para volver a conectar o anastomosar nervios cortados. [6] Se utilizaron espuma de fibrina y trombina para controlar la supuración de los vasos sanguíneos, especialmente en lesiones hepáticas y cerca de tumores. También minimizó el sangrado de las venas grandes y trató las malformaciones de los vasos sanguíneos dentro del cerebro. La película de fibrina se utilizó para detener el sangrado en diversas aplicaciones quirúrgicas, incluida la neurocirugía. [6] Sin embargo, no fue útil para controlar la hemorragia arterial. [5] El primer producto a base de fibrinógeno/fibrina capaz de detener la hemorragia arterial fue el "vendaje sellador de fibrina" o "apósito hemostático (HD)" inventado por Martin MacPhee en la Cruz Roja Americana a principios de los años 1990, y probado en colaboración con el Ejercítio EE.UU. [8] [9]
El método Gerlough, desarrollado en 1955, mejoró la economía del proceso al reducir el consumo de etanol. En lugar del 40% en ciertos pasos, Gerlough utilizó un 20% de etanol para la precipitación. Esto se utiliza especialmente para las Fracciones II y III. Además, Gerlough combinó las dos fracciones con IV en un solo paso para reducir la cantidad de fraccionamientos necesarios. Si bien este método resultó menos costoso, no fue adoptado por la industria debido a esta combinación de las fracciones II, III y IV, por temor a mezclas y altas impurezas. [10]
El método Hink se desarrolló en 1957. Este método proporcionó mayores rendimientos mediante la recuperación de algunas de las proteínas plasmáticas descartadas en las fracciones IV. Los rendimientos mejorados, sin embargo, se equilibraron con las purezas más bajas obtenidas, dentro del rango del 85%. [10]
El método Mulford, similar al Hink, utilizó el sobrenadante de las fracciones II y III como último paso antes del acabado y tratamiento térmico. El método combinaba las fracciones IV y V, pero en este caso la albúmina no sería tan pura, aunque los rendimientos pueden ser mayores. [10]
Kistler y Nitschmann desarrollaron otra variación para proporcionar una forma más pura de albúmina, aunque compensada por rendimientos más bajos. Al igual que en Gerlough, el Precipitado A, que es equivalente a la Fracción II y III de Cohn, se realizó con una concentración de etanol más baja del 19%, pero el pH, en este caso, también fue inferior a 5,85. También de manera similar a Gerlough y Mulford, la fracción IV se combinó y precipitó en condiciones de etanol al 40%, pH de 5,85 y temperatura de -8 grados C. La albúmina, que se recupera en la fracción V, se recupera en el Precipitado C a una Ajuste del pH a 4,8. De manera similar al proceso de Cohn, la albúmina se purifica mediante extracción en agua seguida de precipitación de las impurezas en etanol al 10%, pH 4,6 y -3 grados C. De manera similar al proceso de Cohn, el precipitado formado aquí se filtra y se desecha. Luego, el precipitado C (fracción V) se vuelve a precipitar a pH 5,2 y se almacena como una pasta a -40 grados C. [10] Este proceso ha sido más aceptado porque separa las fracciones y hace que cada etapa sea independiente entre sí.
Otra variación implicó un fraccionamiento térmico de etanol. Fue desarrollado originalmente para inactivar el virus de la hepatitis. En este proceso, el objetivo más importante es la recuperación de albúmina de alto rendimiento y pureza, mientras que se descuidan las demás proteínas plasmáticas. Para garantizar que la albúmina no se desnaturalice con el calor, existen estabilizadores como el octanoato de sodio, que permiten que la albúmina tolere temperaturas más altas durante períodos prolongados. En etanol térmico, el plasma se trata térmicamente a 68 grados C con octanoato de sodio con 9% de etanol a un pH de 6,5. Esto da como resultado una recuperación de albúmina mejorada con rendimientos del 90% y purezas del 100%. No es tan caro como los procedimientos con etanol frío como el Proceso Cohn. Un inconveniente es la presencia de nuevos antígenos debido a una posible desnaturalización térmica de la albúmina. Además, las otras proteínas plasmáticas tienen usos prácticos y no valdría la pena descuidarlas. Finalmente, los costosos recipientes de tratamiento térmico compensan el menor coste respecto al formato de etanol frío que no lo necesita. Por estas razones, varias empresas no han adoptado este método a pesar de que ofrece los resultados más impresionantes. Sin embargo, una organización destacada que lo utiliza es la Cruz Roja Alemana. [10]
La última variación fue desarrollada por Hao en 1979. Este método está significativamente simplificado en comparación con el proceso de Cohn. Su objetivo es crear altos rendimientos de albúmina siempre que la albúmina sea el único producto. Mediante un proceso de dos etapas, las impurezas se precipitan directamente del sobrenadante de las fracciones II y III al 42% de etanol, pH 5,8, temperatura -5 grados C, 1,2% de proteína y fuerza iónica de 0,09. La fracción V se precipita a pH 4,8. Las fracciones I, II, III y IV se coprecipitan en etanol al 40%, con un pH de 5,4 a 7,0 y una temperatura de -3 a -7 grados C. Luego, la fracción V se precipita a un pH de 4,8 y -10 grados C. Los altos rendimientos se deben a una combinación de un proceso simplificado, con menores pérdidas por coprecipitación, y el uso de filtración. También se lograron purezas más altas al 98% debido a los niveles más altos de etanol, pero los rendimientos se redujeron con la alta pureza. [10]
Los métodos más recientes implican el uso de la cromatografía . [11]
El proceso de Cohn supuso un avance importante en el campo del fraccionamiento de la sangre. Tiene varios usos prácticos en el tratamiento de enfermedades como la hepatitis y la polio. Fue más útil durante la Segunda Guerra Mundial, donde los soldados se recuperaron a un ritmo más rápido debido a las transfusiones de albúmina. El Proceso Cohn se ha modificado a lo largo de los años, como se ve arriba. Además, ha influido en otros procesos con la industria del fraccionamiento de sangre. Esto ha dado lugar a nuevas formas de fraccionamiento, como el fraccionamiento cromatográfico de plasma en procesos de intercambio iónico y acabado de albúmina. En general, el Proceso de Cohn y sus variaciones han dado un gran impulso y sirven como base para la industria del fraccionamiento hasta el día de hoy. [12]
Sin embargo, el proceso no ha sido bien estudiado porque es arcaico. Lo más importante es que las empresas manufactureras nunca lo han modernizado. El formato de etanol frío puede ser demasiado suave para matar ciertos virus que requieren inactivación por calor. Dado que este proceso permanece sin cambios durante tanto tiempo, varias ineficiencias e inconsistencias incorporadas afectan la economía del proceso para las empresas farmacéuticas y manufactureras. [12] Una excepción a esto fue la aplicación en Escocia del procesamiento de flujo continuo en lugar del procesamiento por lotes. Este proceso fue ideado en el Centro de Fraccionamiento de Proteínas (PFC), la instalación de fraccionamiento de plasma del Servicio Nacional de Transfusión de Sangre de Escocia (SNBTS). Este proceso implicó monitoreo y control en línea del pH y la temperatura, con control de flujo de corrientes de plasma y etanol mediante bombas de engranajes de precisión, todo bajo control de retroalimentación computarizada. Como resultado, las fracciones de Cohn I+II+III, IV y V se produjeron en unas pocas horas, en lugar de durante muchos días. Posteriormente, la preparación de crioprecipitado en flujo continuo se integró en el proceso anterior al fraccionamiento Cohn. [13]
Sin embargo, este proceso sigue siendo una base importante para la industria de la sangre en general y su influencia puede verse en el desarrollo de métodos más nuevos. Aunque tiene sus inconvenientes según la variación, la principal ventaja del Proceso Cohn son sus usos prácticos y su utilidad dentro de las industrias farmacológicas y médicas. [ cita necesaria ]