La perfusión mecánica (MP) es una técnica de perfusión artificial que se utiliza a menudo para la preservación de órganos y facilita su trasplante . La MP funciona bombeando continuamente una solución especializada a través de los órganos del donante , imitando el flujo sanguíneo natural del cuerpo mientras se controla activamente la temperatura , los niveles de oxígeno , la composición química y el estrés mecánico dentro del órgano. Al mantener la viabilidad del órgano fuera del cuerpo durante períodos prolongados, la perfusión mecánica aborda desafíos críticos en el trasplante de órganos, como los tiempos de preservación limitados. [1] [2] [3]
La perfusión mecánica tiene varias formas y se puede clasificar según la temperatura del perfundido: fría (4 °C) y caliente (37 °C). [4] La perfusión mecánica se ha aplicado al trasplante renal , [5] al trasplante de hígado [6] y al trasplante de pulmón . [7] Es una alternativa al almacenamiento en frío estático (SCS).
En 2022 se informó de un récord de preservación de órganos de trasplante humano con perfusión mecánica de un hígado durante 3 días en lugar de las <12 horas habituales. Es posible que se pueda extender a 10 días y evitar un daño celular sustancial mediante métodos de preservación a baja temperatura. [8] [9] Los enfoques alternativos incluyen nuevos disolventes crioprotectores . [10] [11]
Se está desarrollando un nuevo sistema de perfusión de órganos que puede restaurar, es decir, a nivel celular, múltiples órganos vitales (de cerdo) una hora después de la muerte (durante la cual el cuerpo tuvo una isquemia caliente prolongada ), [12] [13] y un método/sistema similar para revivir cerebros (de cerdo) horas después de la muerte. [12] [14] El sistema de recuperación celular podría usarse para preservar órganos de donantes o para tratamientos de reanimación en emergencias médicas. [12]
Un paso previo esencial para el desarrollo del almacenamiento y trasplante de riñones fue el trabajo de Alexis Carrel en el desarrollo de métodos para la anastomosis vascular . [15] Carrel pasó a describir los primeros trasplantes de riñón, que se realizaron en perros en 1902; Ullman [16] describió de forma independiente experimentos similares en el mismo año. En estos experimentos, se trasplantaron riñones sin que hubiera ningún intento de almacenamiento.
El paso crucial para hacer posible el almacenamiento in vitro de riñones fue la demostración por parte de Fuhrman en 1943 [17] de un efecto reversible de la hipotermia en los procesos metabólicos de tejidos aislados. Antes de esto, los riñones se habían almacenado a temperaturas corporales normales utilizando sangre o perfusados sanguíneos diluidos [18] [19] , pero no se habían realizado reimplantaciones exitosas. Fuhrman demostró que cortes de corteza de riñón y cerebro de rata resistieron el enfriamiento a 0,2 °C durante una hora, temperatura a la que su consumo de oxígeno fue mínimo. Cuando los cortes se recalentaron a 37 °C, su consumo de oxígeno se recuperó a la normalidad.
El efecto beneficioso de la hipotermia sobre los riñones intactos isquémicos fue demostrado por Owens en 1955 [20] cuando demostró que, si se enfriaba a los perros a 23-26 °C y se ocluían sus aortas torácicas durante 2 horas, sus riñones no mostraban daño aparente cuando se los recalentaba. Este efecto protector de la hipotermia sobre el daño isquémico renal fue confirmado por Bogardus [21] quien demostró un efecto protector del enfriamiento de la superficie de los riñones de perros cuyos pedículos renales se sujetaron in situ durante 2 horas. Moyer [22] demostró la aplicabilidad de estos experimentos con perros a los humanos, al mostrar el mismo efecto sobre la función renal de perros y humanos a partir de los mismos períodos de isquemia hipotérmica.
No fue hasta 1958 que se demostró que los riñones intactos de perro sobrevivirían a la isquemia incluso mejor si se enfriaban a temperaturas más bajas. Stueber [23] demostró que los riñones sobrevivirían al pinzamiento in situ del pedículo renal durante 6 horas si los riñones se enfriaban a 0-5 °C colocándolos en una camisa de enfriamiento, y Schloerb [24] demostró que una técnica similar con enfriamiento de riñones de perro heparinizados a 2-4 °C dio protección durante 8 horas pero no 12 horas. Schloerb también intentó el almacenamiento in vitro y el autotrasplante de riñones enfriados, y tuvo un sobreviviente a largo plazo después de 4 horas de almacenamiento del riñón seguido de reimplantación y nefrectomía contralateral inmediata . También tuvo un casi sobreviviente, después de 24 horas de almacenamiento del riñón y nefrectomía contralateral retrasada, en un perro que desarrolló una trombosis arterial tardía en el riñón.
Estos métodos de enfriamiento de la superficie se mejoraron con la introducción de técnicas en las que el sistema vascular del riñón se limpiaba con un líquido frío antes del almacenamiento. Esto tuvo el efecto de aumentar la velocidad de enfriamiento del riñón y eliminar los glóbulos rojos del sistema vascular. Kiser [25] utilizó esta técnica para lograr un almacenamiento in vitro exitoso de 7 horas de un riñón de perro, cuando el riñón se había lavado a 5 °C con una mezcla de dextrano y sangre diluida antes del almacenamiento. En 1960, Lapchinsky [26] confirmó que eran posibles períodos de almacenamiento similares, cuando informó que ocho perros sobrevivieron después de que sus riñones se habían almacenado a 2-4 °C durante 28 horas, seguido de un autotrasplante y una nefrectomía contralateral tardía. Aunque Lapchinsky no dio detalles en su artículo, Humphries [27] informó que estos experimentos habían implicado enfriar los riñones durante 1 hora con sangre fría y luego almacenarlos a 2-4 °C, seguido de un recalentamiento de los riñones durante 1 hora con sangre caliente en el momento de la reimplantación. Las nefrectomías contralaterales se retrasaron dos meses.
Humphries [27] desarrolló esta técnica de almacenamiento perfundiendo continuamente el riñón durante todo el período de almacenamiento. Utilizó plasma o suero diluido como perfundido y señaló la necesidad de presiones bajas de perfundido para prevenir la hinchazón del riñón, pero admitió que los valores óptimos para variables como la temperatura del perfundido, Po2 y el flujo seguían siendo desconocidos. Sus mejores resultados, en ese momento, fueron 2 perros que sobrevivieron después de tener sus riñones almacenados durante 24 horas a 4-10 °C seguido de autotrasplante y nefrectomía contralateral diferida unas semanas después.
Calne [28] cuestionó la necesidad de utilizar métodos de perfusión continua al demostrar que se podía lograr una conservación exitosa durante 12 horas utilizando técnicas mucho más simples. Calne tenía un riñón que sustentaba la vida incluso cuando la nefrectomía contralateral se realizó al mismo tiempo que la operación de reimplantación. Calne simplemente heparinizó riñones de perro y luego los almacenó en una solución helada a 4 °C. Aunque se demostró que era posible la conservación durante 17 horas en un experimento cuando se retrasó la nefrectomía, no se logró ningún éxito con el almacenamiento durante 24 horas.
El siguiente avance lo realizó Humphries [29] en 1964, cuando modificó el perfusado utilizado en su sistema de perfusión continua original y consiguió que un riñón de perro fuera capaz de soportar la vida después de 24 horas de almacenamiento, incluso cuando se realizó una nefrectomía contralateral inmediata al mismo tiempo que la reimplantación. En estos experimentos se utilizó sangre autóloga, diluida al 50% con solución Tis-U-Sol a 10 °C, como perfusado. La presión del perfusado fue de 40 mmHg y el pH del perfusado de 7,11-7,35 (a 37 °C). Se utilizó un pulmón de membrana para la oxigenación para evitar dañar la sangre.
En un intento por mejorar estos resultados, Manax [30] investigó el efecto del oxígeno hiperbárico y descubrió que era posible almacenar con éxito riñones de perros durante 48 horas a 2 °C sin utilizar perfusión continua, cuando los riñones se lavaban con una solución de dextrano /Tis-U-Sol antes del almacenamiento a una presión de 7,9 atmósferas y si la nefrectomía contralateral se retrasaba hasta 2 a 4 semanas después de la reimplantación. Manax postuló que el oxígeno hiperbárico podría funcionar inhibiendo el metabolismo o ayudando a la difusión del oxígeno en las células renales, pero no informó de ningún experimento de control para determinar si otros aspectos de su modelo eran más importantes que la hiperbaria.
En 1967, Belzer [31] logró una mejora notable en los tiempos de almacenamiento cuando informó que había logrado almacenar con éxito el riñón durante 72 horas después de volver a utilizar la perfusión continua utilizando un perfusado basado en plasma canino a 8-12 °C. Belzer [32] descubrió que el factor crucial para permitir una perfusión sin complicaciones durante 72 horas era la crioprecipitación del plasma utilizado en el perfusado para reducir la cantidad de lipoproteínas inestables que, de lo contrario, se precipitaban fuera de la solución y obstruían progresivamente el sistema vascular del riñón. También se utilizó un oxigenador de membrana en el sistema en un intento adicional por evitar la desnaturalización de las lipoproteínas, ya que solo el 35 % de las lipoproteínas se eliminaban mediante crioprecipitación. El perfusado comprendía 1 litro de plasma canino, 4 mEq de sulfato de magnesio , 250 ml de dextrosa , 80 unidades de insulina , 200.000 unidades de penicilina y 100 mg de hidrocortisona . Además de ser crioprecipitado , el perfusado se prefiltró a través de un filtro de 0,22 micrones inmediatamente antes de su uso. Belzer utilizó un pH de perfusado de 7,4-7,5, una Po2 de 150-190 mmHg y una presión de perfusado de 50-80 mmHg sistólica, en una máquina que producía un flujo de perfusado pulsátil. Utilizando este sistema, Belzer logró que 6 perros sobrevivieran después de que sus riñones se hubieran almacenado durante 72 horas y luego se los hubiera reimplantado, y se realizaron nefrectomías contralaterales inmediatas en las operaciones de reimplantación.
El uso de hidrocortisona por parte de Belzer como coadyuvante para la conservación había sido sugerido por el trabajo de Lotke con cortes de riñón de perro, [33] en el que la hidrocortisona mejoró la capacidad de los cortes para excretar HAP y oxígeno después de 30 horas de almacenamiento a 2-4 °C; Lotke sugirió que la hidrocortisona podría estar actuando como un estabilizador de la membrana lisosomal en estos experimentos. Los otros componentes del modelo de Belzer se obtuvieron empíricamente. La insulina y el magnesio se utilizaron parcialmente en un intento de inducir la hibernación artificial , ya que Suomalainen [34] encontró que este régimen era eficaz para inducir la hibernación en hibernadores naturales. El magnesio también se proporcionó como un inhibidor metabólico después de la demostración de Kamiyama [35] de que era un agente eficaz en la conservación del corazón de perro. Una justificación adicional para el magnesio fue que era necesario para reemplazar el calcio que había sido unido por citrato en el plasma .
Belzer [36] demostró la aplicabilidad de sus experimentos con perros al almacenamiento de riñones humanos cuando informó sobre sus experiencias en trasplantes renales humanos utilizando las mismas técnicas de almacenamiento que había utilizado para riñones de perros. Pudo almacenar riñones hasta por 50 horas y solo el 8% de los pacientes requirieron diálisis posoperatoria cuando el donante había sido bien preparado.
En 1968, Humphries [37] informó de que 1 de 14 perros sobrevivió tras almacenar sus riñones durante 5 días en una máquina de perfusión a 10 °C, utilizando un medio de plasma diluido que contenía ácidos grasos adicionales. Sin embargo, en estos experimentos fue necesaria una nefrectomía contralateral diferida 4 semanas después de la reimplantación para lograr el éxito, y esto indicó que los riñones sufrieron daños graves durante el almacenamiento.
En 1969, Collins [38] informó una mejora en los resultados que se podían lograr con métodos simples sin perfusión de almacenamiento hipotérmico de riñones. Basó su técnica en la observación de Keller [39] de que la pérdida de electrolitos de un riñón durante el almacenamiento se podía prevenir mediante el uso de un fluido de almacenamiento que contenía cationes en cantidades cercanas a las que normalmente están presentes en las células. En el modelo de Collins, los perros estaban bien hidratados antes de la nefrectomía y también se les administró manitol para inducir una diuresis . Se inyectó fenoxibenzamina, un vasodilatador y estabilizador de enzimas lisosómicas, [40] [41] en la arteria renal antes de la nefrectomía. Los riñones se sumergieron en solución salina inmediatamente después de la extracción y se perfundieron a través de la arteria renal con 100-150 ml de una solución electrolítica fría desde una altura de 100 cm. Los riñones permanecieron en solución salina helada durante el resto del período de almacenamiento. La solución utilizada para estas perfusiones frías exitosas imitaba la composición electrolítica de los fluidos intracelulares al contener grandes cantidades de potasio y magnesio. La solución también contenía glucosa, heparina, procaína y fenoxibenzamina. El pH de la solución era 7,0 a 25 °C. Collins pudo lograr un almacenamiento exitoso de 24 horas de 6 riñones y de 30 horas de 3 riñones, con los riñones funcionando inmediatamente después de la reimplantación, a pesar de las nefrectomías contralaterales inmediatas. Collins enfatizó los malos resultados obtenidos con un lavado con solución de Ringer, al encontrar resultados similares con este manejo cuando se comparó con los riñones tratados solo con enfriamiento de la superficie. Liu [42] informó que la solución de Collins podía brindar un almacenamiento exitoso de 48 horas cuando la solución se modificaba con la inclusión de aminoácidos y vitaminas. Sin embargo, Liu no realizó experimentos de control para demostrar que estas modificaciones fueran cruciales.
Otros investigadores encontraron dificultades para repetir los exitosos experimentos de almacenamiento en perfusión de 72 horas de Belzer. Woods [43] pudo lograr un almacenamiento exitoso de 48 horas de 3 de 6 riñones cuando utilizó los aditivos de Belzer con plasma crioprecipitado como perfundido en un sistema de perfusión hipotérmica, pero no pudo extender el tiempo de almacenamiento a 72 horas como lo había hecho Belzer. Sin embargo, Woods [44] logró posteriormente un almacenamiento exitoso de 3 y 7 días de riñones de perro. Woods había modificado el perfundido de Belzer añadiendo 250 mg de metilprednisolona, aumentó el contenido de sulfato de magnesio a 16,2 mEq y la insulina a 320 unidades. Seis de los 6 riñones produjeron una función de soporte vital cuando se reimplantaron después de 72 horas de almacenamiento a pesar de las nefrectomías contralaterales inmediatas; 1 de los 2 riñones funcionó como un soporte vital después de 96 horas de almacenamiento, 1 de los 2 después de 120 horas de almacenamiento y 1 de los 2 después de 168 horas de almacenamiento. La presión de perfusión fue de 60 mmHg con una velocidad de bombeo de perfusión de 70 latidos por minuto, y el pH de perfusión se mantuvo automáticamente a 7,4 mediante un titulador de CO2 . Woods destacó la importancia de la hidratación de los animales donantes y receptores. Sin la metilprednisolona, Woods descubrió que la fragilidad de los vasos era un problema cuando los tiempos de almacenamiento eran superiores a 48 horas.
En 1972 [46] , Johnson [45] y Claes simplificaron considerablemente las técnicas de almacenamiento de perfusión hipotérmica con la introducción de un perfusado a base de albúmina. Este perfusado eliminó la necesidad de fabricar el plasma crioprecipitado y filtrado por miliporos que utilizaba Belzer. La preparación de este perfusado había sido laboriosa y requería mucho tiempo, y existía el riesgo potencial de contraer el virus de la hepatitis y los anticuerpos citotóxicos. La ausencia de lipoproteínas en el perfusado significó que el oxigenador de membrana podía eliminarse del circuito de perfusión, ya que no era necesario evitar una interfaz entre el perfusado y el aire para prevenir la precipitación de lipoproteínas. Ambos trabajadores utilizaron los mismos aditivos recomendados por Belzer.
La solución que utilizó Johnson fue preparada por el Blood Products Laboratory (Elstree: Inglaterra) extrayendo fibrinógeno y gammaglobulinas termolábiles del plasma para dar una solución de fracción de proteína plasmática (PPF). La solución se incubó a 60 °C durante 10 horas para inactivar el agente de la hepatitis sérica. [47] El resultado fue una solución de albúmina humana de 45 g/L que contenía pequeñas cantidades de gamma y beta globulinas que se mantuvo estable entre 0 °C y 30 °C durante 5 años. [48] La PPF contenía 2,2 mmol/L de ácidos grasos libres. [49]
Los experimentos de Johnson [45] se centraron principalmente en el almacenamiento de riñones que habían sido dañados por una lesión prolongada por calor. Sin embargo, en un grupo de control de riñones de perros que no habían sufrido lesiones por calor, Johnson demostró que se lograba fácilmente una conservación durante 24 horas cuando se utilizaba un perfusado de PPF, y describió en otro lugar [50] un superviviente tras 72 horas de perfusión y reimplantación con nefrectomía contralateral inmediata. Con riñones lesionados por calor, la perfusión con PPF dio mejores resultados que el método de Collins, ya que 6 de los 6 perros sobrevivieron tras 40 minutos de lesión por calor y 24 horas de almacenamiento seguido de reimplantación de los riñones y nefrectomía contralateral inmediata. Se añadieron potasio, magnesio, insulina, glucosa, hidrocortisona y ampicilina a la solución de PPF para proporcionar una fuente de energía y evitar la fuga de potasio intracelular. La temperatura del perfusado fue de 6 °C, la presión de 40 a 80 mm Hg y la Po2 de 200 a 400 mm Hg. El pH se mantuvo entre 7,2 y 7,4.
Claes [46] utilizó un perfusado basado en albúmina humana (Kabi: Suecia) diluida con solución salina a una concentración de 45 g/L. Claes preservó 4 de 5 riñones de perro durante 96 horas y los riñones funcionaron inmediatamente después de la reimplantación a pesar de las nefrectomías contralaterales inmediatas. Claes también comparó este perfusado con el plasma crioprecipitado de Belzer en un grupo de control y no encontró diferencias significativas entre la función de los riñones reimplantados en los dos grupos.
El único otro grupo además del de Woods que informó un almacenamiento exitoso de riñones durante siete días fue Liu y Humphries [51] en 1973. Tuvieron tres de siete perros que sobrevivieron, después de que sus riñones habían sido almacenados durante siete días seguidos de reimplantación y nefrectomía contralateral inmediata. Su mejor perro tuvo un pico de creatinina posterior a la reimplantación de 50 mg/L (0,44 mmol/L). Liu utilizó perros bien hidratados sometidos a una diuresis con manitol y almacenó los riñones a 9 °C - 10 °C utilizando un perfusado derivado de PPF humano. El PPF se fraccionó aún más utilizando un polímero altamente soluble en agua (Pluronic F-38), y se agregaron acetil triptofanato de sodio y caprilato de sodio al PPF como estabilizadores para permitir la pasteurización. A esta solución se le añadieron albúmina humana, heparina, manitol, glucosa, sulfato de magnesio, cloruro de potasio, insulina, metilprednisolona, carbenicilina y agua para ajustar la osmolalidad a 300-310 mosmol /kg. El perfusado se intercambió después de 3,5 días de almacenamiento. La presión del perfusado fue de 60 mmHg o menos, a una velocidad de bombeo de 60 por minuto. El pH del perfusado fue de 7,12-7,32 (a 37 °C), Pco2 de 27-47 mmHg y Po2 de 173-219 mmHg. En un informe posterior sobre este estudio, Humphries [52] descubrió que cuando se repitieron los experimentos con un nuevo lote de PPF no se obtuvieron supervivientes, y la histología de los supervivientes del experimento original mostró hipercelularidad glomerular que atribuyó a un posible efecto tóxico del polímero Pluronic.
Joyce y Proctor [53] informaron sobre el uso exitoso de un perfusado simple basado en dextrano para el almacenamiento de riñones de perros durante 72 horas. 10 de los 17 riñones fueron viables después de la reimplantación y la nefrectomía contralateral inmediata. Joyce utilizó una perfusión no pulsátil a 4 °C con un perfusado que contenía dextrano 70 (Pharmacia) al 2,1%, con electrolitos adicionales, glucosa (19,5 g/L), procaína e hidrocortisona. El perfusado no contenía plasma ni componentes plasmáticos. La presión del perfusado fue de solo 30 cm H2O , pH 7,34-7,40 y Po2 250-400 mm Hg. Este trabajo demostró que, para el almacenamiento de 72 horas, no se necesitaban otros nutrientes además de la glucosa y las presiones y flujos de perfusado bajos eran adecuados.
En 1973, Sacks [54] demostró que el simple almacenamiento en hielo podía utilizarse con éxito para el almacenamiento de 72 horas cuando se utilizaba una nueva solución de lavado para el enfriamiento inicial y el lavado del riñón. Sacks extrajo los riñones de perros bien hidratados que estaban diuréticos después de una infusión de manitol y los lavó con 200 ml de solución desde una altura de 100 cm. Luego, los riñones simplemente se mantuvieron a 2 °C durante 72 horas sin más perfusión. La reimplantación fue seguida por nefrectomías contralaterales inmediatas. La solución de lavado fue diseñada para imitar la composición del fluido intracelular y contenía manitol como un ion impermeable para prevenir aún más la hinchazón celular. La osmolalidad de la solución fue de 430 mosmol/kg y su pH fue de 7,0 a 2 °C. Sacks omitió los aditivos que había utilizado Collins (dextrosa, fenoxibenzamina, procaína y heparina).
Estos resultados han sido igualados por Ross [55], quien también logró un almacenamiento exitoso de 72 horas sin usar perfusión continua, aunque no pudo reproducir los resultados de Collins o Sacks utilizando las soluciones originales de Collins o Sacks. La solución exitosa de Ross fue similar en composición de electrolitos al líquido intracelular con la adición de citrato hipertónico y manitol. No había fosfato, bicarbonato, cloruro o glucosa presentes en la solución; la osmolalidad fue de 400 mosmol/kg y el pH de 7,1. Cinco de los 8 perros sobrevivieron a la reimplantación de sus riñones y a la nefrectomía contralateral inmediata, cuando los riñones habían sido almacenados durante 72 horas después de haber sido lavados con la solución de Ross; pero Ross no pudo lograr un almacenamiento de 7 días con esta técnica incluso cuando se utilizó la nefrectomía contralateral tardía.
Los requisitos para un almacenamiento exitoso de perfusión hipotérmica de 72 horas han sido definidos con más detalle por Collins, quien demostró que no era necesaria la perfusión pulsátil si se utilizaba una presión de perfusión de 49 mmHg, y que 7 °C era una mejor temperatura para el almacenamiento que 2 °C o 12 °C. [56] [57] También comparó varias composiciones de perfusión y descubrió que se podía utilizar con éxito una perfusión tamponada con fosfato, eliminando así la necesidad de un suministro de dióxido de carbono. [56] Grundmann [58] también ha demostrado que una presión baja de perfusión es adecuada. Utilizó una presión pulsátil media de 20 mmHg en perfusiones de 72 horas y descubrió que esto daba mejores resultados que las presiones medias de 15, 40, 50 o 60 mmHg.
Cohen [59] informó que se logró un almacenamiento exitoso de hasta 8 días utilizando varios tipos de perfusato; el mejor resultado se obtuvo al utilizar un perfusato tamponado con fosfato a 8 °C. Se pensó que la incapacidad de repetir estos experimentos exitosos se debía a los cambios que se habían realizado en la forma en que se fabricaba el PPF, con un mayor contenido de ácido octanoico que era perjudicial. Se demostró que el ácido octanoico puede estimular la actividad metabólica durante la perfusión hipotérmica [60] y esto podría ser perjudicial.
Los cambios estructurales que ocurren durante el almacenamiento hipotérmico de 72 horas de riñones previamente no dañados han sido descritos por Mackay [61] quien mostró cómo había una vacuolización progresiva del citoplasma de las células que afectaba particularmente a los túbulos proximales . En la microscopía electrónica se vio que las mitocondrias se hinchaban con una separación temprana de las membranas cristalinas internas y una pérdida posterior de toda la estructura interna. La integridad lisosomal se conservó bien hasta el final, y la destrucción de la célula no pareció ser causada por enzimas líticas porque no hubo más daño inmediatamente adyacente a los lisosomas que en el resto de la célula. [ cita requerida ]
Woods [44] [62] y Liu [51] , al describir el almacenamiento exitoso de riñones durante 5 y 7 días, describieron los cambios microscópicos ópticos observados al final de la perfusión y en la autopsia, pero encontraron pocas anomalías macroscópicas aparte de cierta infiltración con linfocitos y atrofia tubular ocasional.
Hill [63] describió los cambios durante perfusiones cortas de riñones humanos antes de la reimplantación y también realizó biopsias una hora después de la reimplantación. En la microscopía electrónica, Hill encontró daño endotelial que se correlacionaba con la gravedad de la deposición de fibrina después de la reimplantación. Los cambios que Hill vio en los glomérulos en la microscopía óptica fueron trombos de fibrina ocasionales e infiltración con polimorfos. Hill sospechó que estos cambios eran una lesión inducida inmunológicamente, pero descubrió que no había correlación entre la gravedad de la lesión histológica y la presencia o ausencia de depósitos de inmunoglobulina. [ cita requerida ]
Existen varios informes sobre el análisis de la orina producida por los riñones durante el almacenamiento en perfusión. Kastagir [64] analizó la orina producida durante una perfusión de 24 horas y descubrió que era un ultrafiltrado del perfusado; Scott [65] encontró un rastro de proteína en la orina durante el almacenamiento de 24 horas y Pederson [66] encontró solo un rastro de proteína después de 36 horas de almacenamiento en perfusión. Pederson mencionó que había encontrado proteinuria intensa durante experimentos anteriores. Woods [62] notó cilindros de proteína en los túbulos de riñones viables después de 5 días de almacenamiento, pero no analizó la orina producida durante la perfusión. En el estudio de Cohen [59] hubo un aumento progresivo en la concentración de proteína urinaria durante 8 días de conservación hasta que el contenido de proteína de la orina igualó al del perfusado. Esto puede haber estado relacionado con la hinchazón de las membranas basales glomerulares y la fusión progresiva de los procesos del pie de las células epiteliales que también se observó durante el mismo período de almacenamiento en perfusión.
Los mecanismos que dañan los riñones durante el almacenamiento hipotérmico se pueden subdividir de la siguiente manera:
A temperaturas normales, los mecanismos de bombeo de las paredes celulares retienen el potasio intracelular en niveles altos y extruyen sodio. Si estas bombas fallan, la célula absorbe el sodio y pierde potasio. El agua sigue al sodio de forma pasiva y da como resultado la hinchazón de las células. La importancia de este control de la hinchazón celular fue demostrada por McLoughlin [67], quien encontró una correlación significativa entre el contenido de agua cortical renal canino y la capacidad de los riñones para soportar la vida después de 36 horas de almacenamiento. El mecanismo de bombeo es impulsado por el sistema enzimático conocido como ATPasa activada por Na+K+ [68] y es inhibido por el frío. Levy [69] encontró que la actividad metabólica a 10 °C, como lo indican las mediciones del consumo de oxígeno, se redujo a aproximadamente el 5% de lo normal y, debido a que todos los sistemas enzimáticos se ven afectados de manera similar por la hipotermia, la actividad de la ATPasa se reduce notablemente a 10 °C.
Sin embargo, existen diferencias de tejido y especie en la sensibilidad al frío de esta ATPasa que pueden explicar las diferencias en la capacidad de los tejidos para soportar la hipotermia. Martin [70] ha demostrado que en las células corticales del riñón de perro todavía hay cierta actividad de ATPasa a 10 °C, pero no a 0 °C. En las células del hígado y del corazón, la actividad se inhibió completamente a 10 °C y esta diferencia en la sensibilidad al frío de la ATPasa se correlacionó con la mayor dificultad para controlar la hinchazón celular durante el almacenamiento hipotérmico de las células del hígado y del corazón. Se encuentra una ATPasa distinta en las paredes de los vasos, y Belzer [71] demostró que está completamente inhibida a 10 °C, cuando a esta temperatura la ATPasa de las células corticales del riñón todavía está activa. Estos experimentos se realizaron en el endotelio aórtico, pero si el endotelio vascular del riñón tiene las mismas propiedades, entonces la lesión vascular puede ser el factor limitante en el almacenamiento renal prolongado.
Willis [72] ha demostrado cómo los organismos que hibernan obtienen parte de su capacidad para sobrevivir a bajas temperaturas al tener una Na+K+-ATPasa que es capaz de transportar sodio y potasio activamente a través de sus membranas celulares, a 5 °C, aproximadamente seis veces más rápido que en los organismos que no hibernan; esta tasa de transporte es suficiente para prevenir la hinchazón celular.
La velocidad de enfriamiento de un tejido también puede ser significativa en la producción de daño a los sistemas enzimáticos. Francavilla [73] demostró que cuando se enfriaron rápidamente cortes de hígado (enfriamiento inmediato a 12 °C en 6 minutos), la glucólisis anaeróbica, medida al recalentar a 37 °C, se inhibió en aproximadamente el 67% de la actividad que se demostró en cortes que se habían sometido a enfriamiento retardado. Sin embargo, los cortes de riñón de perro se vieron menos afectados por el enfriamiento rápido que los cortes de hígado.
Todas las células necesitan ATP como fuente de energía para su actividad metabólica. El riñón se daña por anoxia cuando las células corticales del riñón no pueden generar suficiente ATP en condiciones anaeróbicas para satisfacer las necesidades de las células. Cuando se extirpa un riñón, es inevitable que se produzca cierta anoxia en el intervalo entre la división de la arteria renal y el enfriamiento del riñón. Bergstrom [74] ha demostrado que el 50% del contenido de ATP de las células corticales del riñón de un perro se pierde en el plazo de 1 minuto tras pinzar la arteria renal, y Warnick [75] encontró resultados similares en riñones de ratones enteros, con una caída del ATP celular del 50% después de unos 30 segundos de anoxia caliente. Warnick y Bergstrom también demostraron que enfriar el riñón inmediatamente después de la extracción reducía notablemente cualquier pérdida adicional de ATP. Cuando estos riñones no lesionados por el calor se perfundieron con plasma hipotérmico oxigenado, los niveles de ATP se redujeron en un 50% después de un almacenamiento de 24 horas y, después de 48 horas, los niveles medios de ATP en el tejido fueron un poco más altos que esto, lo que indica que se había producido la síntesis de ATP. Pegg [76] ha demostrado que los riñones de conejo pueden resintetizar ATP después de un período de almacenamiento por perfusión después de una lesión por el calor, pero no se produjo resíntesis en los riñones no lesionados por el calor.
La anoxia por calor también puede ocurrir durante la reimplantación del riñón después del almacenamiento. Lannon [77] demostró, mediante mediciones del metabolismo del succinato, cómo el riñón era más sensible a un período de hipoxia por calor que se producía después del almacenamiento que al mismo período de hipoxia por calor que se producía inmediatamente antes del almacenamiento.
Pettersson [78] y Cohen [59] han demostrado un metabolismo activo de la glucosa con producción de bicarbonato .
Los estudios de Pettersson [78] se centraron en el metabolismo de la glucosa y los ácidos grasos por los riñones durante un almacenamiento en perfusión hipotérmica de 6 días y descubrió que los riñones consumían glucosa a una tasa de 4,4 μmol/g/día y ácidos grasos a una tasa de 5,8 μmol/g/día. En el estudio de Cohen [59], los mejores riñones almacenados durante 8 días consumían glucosa a una tasa de 2,3 μmol/g/día y 4,9 μmol/g/día respectivamente, lo que hacía probable que estuvieran utilizando ácidos grasos a tasas similares a las de los riñones de los perros de Pettersson. La constancia tanto de la tasa de consumo de glucosa como de la tasa de producción de bicarbonato implicaba que no había ninguna lesión que afectara a los sistemas enzimáticos glucolíticos o anhidrasa carbónica.
Lee [79] demostró que los ácidos grasos eran el sustrato preferido de la corteza renal del conejo a temperaturas normotérmicas, y la glucosa el sustrato preferido para las células medulares que normalmente metabolizan anaeróbicamente. Abodeely [80] demostró que tanto los ácidos grasos como la glucosa podían ser utilizados por la médula externa del riñón del conejo, pero que la glucosa se utilizaba preferentemente. En la hipotermia, las necesidades metabólicas del riñón se reducen mucho, pero se produce un consumo mensurable de glucosa, ácidos grasos y cuerpos cetónicos. Horsburgh [49] demostró que los lípidos son utilizados por los riñones hipotérmicos, siendo el consumo de palmitato de 0-15% de lo normal en la corteza renal de la rata a 15 °C. Pettersson [78] demostró que, sobre una base molar, la glucosa y los ácidos grasos se metabolizaban por los riñones perfundidos hipotérmicamente a aproximadamente las mismas tasas. Huang [81] demostró que la corteza del riñón de perro hipotérmico perdía lípidos (pérdida del 35 % del lípido total después de 24 horas) a menos que se añadiera oleato al perfusado del riñón. Huang comentó que esta pérdida podría afectar a la estructura de la célula y que la pérdida también sugería que el riñón estaba utilizando ácidos grasos. En una publicación posterior, Huang [82] demostró que las rebanadas de corteza de riñón de perro metabolizaban ácidos grasos, pero no glucosa, a 10 °C.
Incluso si se proporcionan los nutrientes correctos, pueden perderse por absorción en los tubos del sistema de conservación. Lee [83] demostró que el caucho de silicona (un material ampliamente utilizado en los sistemas de conservación de riñones) absorbía el 46% del ácido oleico de un perfusado después de 4 horas de perfusión.
Abouna [84] demostró que se liberaba amoníaco en el perfusado durante el almacenamiento renal de 3 días y sugirió que esto podría ser tóxico para las células renales a menos que se elimine mediante el reemplazo frecuente del perfusado. Liu [51] brindó cierto respaldo al uso del intercambio de perfusado durante perfusiones prolongadas, quien utilizó el intercambio de perfusado en sus exitosos experimentos de almacenamiento de 7 días. Grundmann [85] también descubrió que la calidad de conservación de 96 horas mejoraba con el uso de un volumen doble de perfusado o con el intercambio de perfusado. Sin embargo, las conclusiones de Grundmann se basaron en comparaciones con un grupo de control de solo 3 perros. Cohen [59] no pudo demostrar ninguna producción de amoníaco durante 8 días de perfusión ni ningún beneficio del intercambio de perfusado; se demostró que la alcalinidad progresiva que se produjo durante la perfusión se debía a la producción de bicarbonato.
Se ha demostrado que ciertos perfusados tienen efectos tóxicos sobre los riñones como resultado de la inclusión inadvertida de determinadas sustancias químicas en su formulación. Collins [86] demostró que la procaína incluida en la formulación de sus líquidos de lavado podía ser tóxica, y Pegg [87] ha comentado cómo los materiales tóxicos, como los plastificantes de PVC, pueden eliminarse de los tubos del circuito de perfusión. Dvorak [88] demostró que la adición de metilprednisolona al perfusado, que Woods [62] consideraba esencial, podría ser perjudicial en algunas circunstancias. Demostró que con más de 100 mg de metilprednisolona en 650 ml de perfusado (en comparación con los 250 mg en 1 litro utilizados por Woods), se produjeron cambios hemodinámicos y estructurales irreversibles en el riñón después de 20 horas de perfusión. Hubo necrosis de las asas capilares, oclusión de los espacios de Bowman, engrosamiento de la membrana basal y daño de las células endoteliales.
Warnick [75] consideró que el nivel de nucleótidos que quedan en la célula después del almacenamiento es importante para determinar si la célula será capaz de resintetizar ATP y recuperarse después del recalentamiento. El cambio frecuente del perfusado o el uso de un gran volumen de perfusado tiene la desventaja teórica de que los nucleótidos de adenina degradados pueden ser eliminados de las células y, por lo tanto, no estar disponibles para la resintetización en ATP cuando se recalienta el riñón.
El ADN nuclear se daña durante el almacenamiento en frío de los riñones. Lazarus [89] demostró que las roturas de ADN monocatenario se produjeron en un plazo de 16 horas en riñones de ratones almacenados en condiciones hipotérmicas, y que la lesión se inhibió un poco mediante el almacenamiento en soluciones de Collins o Sacks. Esta lesión nuclear difería de la observada en la lesión en caliente cuando se produjeron roturas de ADN bicatenario. [90]
Los métodos de almacenamiento por perfusión pueden lesionar mecánicamente el endotelio vascular del riñón, lo que conduce a una trombosis arterial o a un depósito de fibrina después de la reimplantación. Hill [63] observó que, en los riñones humanos, el depósito de fibrina en el glomérulo después de la reimplantación y la función posoperatoria se correlacionaban con la duración del almacenamiento por perfusión. Había tomado biopsias en la revascularización de riñones humanos conservados por perfusión o almacenamiento en hielo, y demostró mediante microscopía electrónica que la alteración endotelial solo se produjo en aquellos riñones que habían sido perfundidos. Las biopsias tomadas una hora después de la revascularización mostraron plaquetas y fibrina adheridas a cualquier área de la membrana basal vascular denudada. Sheil [91] describió un tipo diferente de daño vascular y demostró cómo se podía producir una lesión por chorro distal a la cánula atada a la arteria renal, lo que provocaba una trombosis arterial aproximadamente a 1 cm distal al sitio de la cánula.
Hay evidencia de que los mecanismos inmunológicos pueden dañar los riñones perfundidos hipotérmicamente después de la reimplantación si el perfundido contenía un anticuerpo específico. Cross [92] describió dos pares de riñones de cadáveres humanos que fueron perfundidos simultáneamente con plasma crioprecipitado que contenía un anticuerpo HLA específico de tipo para uno de los pares. Ambos riñones sufrieron una trombosis arterial temprana. Light [93] describió un rechazo hiperagudo similar después del almacenamiento de la perfusión y demostró que el plasma crioprecipitado utilizado contenía anticuerpo IgM citotóxico. Este peligro potencial del uso de plasma crioprecipitado fue demostrado experimentalmente por Filo [94], quien perfundió riñones de perro durante 24 horas con plasma de perro crioprecipitado específicamente sensibilizado y descubrió que podía inducir lesiones glomerulares y vasculares con congestión capilar, hinchazón endotelial, infiltración por leucocitos polimorfonucleares y trombosis arterial. La microscopía inmunofluorescente demostró la unión específica de IgG a lo largo de las superficies endoteliales, en los glomérulos y también en los vasos. Después de la reimplantación, la fijación del complemento y el daño tisular se produjeron de forma similar. Se observó cierta correlación entre la gravedad del daño histológico y la función renal posterior.
Muchos investigadores han intentado evitar que los riñones se recalienten durante la reimplantación, pero sólo Cohen ha descrito el uso de un sistema de enfriamiento activo. [59] Las mediciones de la liberación de enzimas lisosomales de los riñones sometidos a anastomosis simuladas, tanto dentro como fuera del sistema de enfriamiento, demostraron lo sensibles que eran los riñones al recalentamiento después de un período de almacenamiento en frío, y confirmaron la eficacia del sistema de enfriamiento para prevenir la liberación de enzimas. Otro factor para minimizar las lesiones en las operaciones de reimplantación puede haber sido que los riñones se mantuvieron a 7 °C dentro del serpentín de enfriamiento, que estaba dentro de un grado de la temperatura utilizada durante el almacenamiento de perfusión, de modo que los riñones no estuvieron sujetos a los mayores cambios de temperatura que se habrían producido si se hubiera utilizado enfriamiento con hielo.
Dempster [95] describió el uso de la liberación lenta de las pinzas vasculares al final de las operaciones de reimplantación renal para evitar lesionar el riñón, pero otros investigadores no han mencionado si utilizaron o no esta maniobra. Después de que Cohen encontrara una lesión vascular con sangrado intrarrenal después de 3 días de almacenamiento de la perfusión, [59] se utilizó una técnica de revascularización lenta para todos los experimentos posteriores, con el objetivo de dar tiempo a los vasos intrarrenales para recuperar su tono lo suficiente como para evitar que se aplicara una presión sistólica completa a los frágiles vasos glomerulares. La ausencia de lesión vascular macroscópica en sus perfusiones posteriores puede atribuirse al uso de esta maniobra.
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