Los neurofilamentos ( NF ) se clasifican como filamentos intermedios de tipo IV que se encuentran en el citoplasma de las neuronas . Son polímeros proteicos que miden 10 nm de diámetro y muchos micrómetros de longitud. [1] Junto con los microtúbulos (~25 nm) y los microfilamentos (7 nm), forman el citoesqueleto neuronal . Se cree que funcionan principalmente para proporcionar soporte estructural a los axones y regular el diámetro de los axones, lo que influye en la velocidad de conducción nerviosa . Las proteínas que forman los neurofilamentos son miembros de la familia de proteínas de los filamentos intermedios, que se divide en seis tipos según su organización genética y estructura proteica. Los tipos I y II son las queratinas que se expresan en los epitelios. El tipo III contiene las proteínas vimentina , desmina , periferina y proteína ácida fibrilar glial (GFAP). El tipo IV consta de las proteínas de neurofilamentos NF-L, NF-M, NF-H y α-internexina . El tipo V está formado por las láminas nucleares y el tipo VI está formado por la proteína nestina . Todos los genes de filamentos intermedios de tipo IV comparten dos intrones únicos que no se encuentran en otras secuencias de genes de filamentos intermedios, lo que sugiere un origen evolutivo común a partir de un gen de tipo IV primitivo.
Cualquier filamento proteico que se extiende en el citoplasma de una célula nerviosa también se denomina neurofibrilla . [2] Este nombre se utiliza en los ovillos neurofibrilares de algunas enfermedades neurodegenerativas .
La composición proteica de los neurofilamentos varía ampliamente entre los diferentes filos animales. Se sabe más sobre los neurofilamentos de los mamíferos. Históricamente, originalmente se pensaba que los neurofilamentos de los mamíferos estaban compuestos por solo tres proteínas llamadas proteína de neurofilamento NF-L (bajo peso molecular; NF-L ), NF-M (peso molecular medio; NF-M ) y NF-H (peso molecular alto). ; NF-H ). Estas proteínas se descubrieron a partir de estudios de transporte axonal y a menudo se las denomina "triplete de neurofilamentos". [3] Sin embargo, ahora está claro que los neurofilamentos también contienen la proteína α-internexina [4] y que los neurofilamentos en el sistema nervioso periférico también pueden contener la proteína periferina. [5] (esto es diferente de la periferina 2 que se expresa en la retina ). Así, los neurofilamentos de los mamíferos son heteropolímeros de hasta cinco proteínas diferentes: NF-L, NF-M, NF-H, α-internexina y periferina. Las cinco proteínas de los neurofilamentos pueden coensamblarse en diferentes combinaciones en diferentes tipos de células nerviosas y en diferentes etapas de desarrollo. La composición precisa de los neurofilamentos en cualquier célula nerviosa depende de los niveles de expresión relativos de las proteínas de los neurofilamentos en la célula en ese momento. Por ejemplo, la expresión de NF-H es baja en las neuronas en desarrollo y aumenta posnatalmente en las neuronas con axones mielinizados. [6] En el sistema nervioso adulto, los neurofilamentos de los axones pequeños no mielinizados contienen más periferina y menos NF-H, mientras que los neurofilamentos de los axones mielinizados grandes contienen más NF-H y menos periferina. La subunidad del filamento intermedio de tipo III, vimentina , se expresa en neuronas en desarrollo y en algunas neuronas muy inusuales en el adulto en asociación con proteínas de tipo IV, como las neuronas horizontales de la retina .
Las proteínas tripletes se nombran según su tamaño relativo (bajo, medio, alto). La masa molecular aparente de cada proteína determinada por SDS-PAGE es mayor que la masa predicha a partir de la secuencia de aminoácidos. Esto se debe a la migración electroforética anómala de estas proteínas y es particularmente extremo para las proteínas de neurofilamentos NF-M y NF-H debido a su alto contenido de aminoácidos cargados y su extensa fosforilación. Las tres proteínas tripletes de neurofilamentos contienen largos tramos de secuencia polipeptídica rica en ácido glutámico y residuos de lisina , y NF-M y especialmente NF-H también contienen múltiples sitios de fosforilación de serina repetidos en tándem . Casi todos estos sitios contienen el péptido lisina-serina-prolina (KSP), y la fosforilación normalmente se encuentra en neurofilamentos axonales y no dendríticos. La NF-M humana tiene 13 de estos sitios KSP, mientras que la NF-H humana se expresa a partir de dos alelos, uno de los cuales produce 44 y el otro 45 repeticiones de KSP.
Al igual que otras proteínas de filamentos intermedios, todas las proteínas de neurofilamentos comparten una región alfa helicoidal central común , conocida como dominio de varilla debido a su estructura terciaria en forma de varilla, flanqueada por dominios amino terminal y carboxi terminal que en gran medida no están estructurados. Los dominios de varilla de dos proteínas de neurofilamentos se dimerizan para formar una espiral alfa-helicoidal . Dos dímeros se asocian de manera antiparalela al tresbolillo para formar un tetrámero. Se cree que este tetrámero es la subunidad básica (es decir, el componente básico) del neurofilamento. Las subunidades del tetrámero se asocian de lado a lado para formar filamentos de longitud unitaria, que luego se hibridan de extremo a extremo para formar el polímero de neurofilamento maduro, pero se desconoce la organización precisa de estas subunidades dentro del polímero, en gran parte debido a la proteína heterogénea. composición y la incapacidad de cristalizar neurofilamentos o proteínas de neurofilamentos. Los modelos estructurales generalmente suponen ocho tetrámeros (32 polipéptidos de neurofilamentos) en una sección transversal de filamento, pero las mediciones de densidad de masa lineal sugieren que esto puede variar.
Los dominios amino terminales de las proteínas de los neurofilamentos contienen numerosos sitios de fosforilación y parecen ser importantes para las interacciones de las subunidades durante el ensamblaje de los filamentos. Los dominios carboxi terminales parecen ser dominios intrínsecamente desordenados que carecen de hélice alfa o lámina beta. Los diferentes tamaños de las proteínas de los neurofilamentos se deben en gran medida a diferencias en la longitud de los dominios carboxi terminales. Estos dominios son ricos en residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Los dominios carboxi terminales de NF-M y NF-H son los más largos y se modifican ampliamente mediante modificaciones postraduccionales como la fosforilación y la glicosilación in vivo. Se proyectan radialmente desde la columna vertebral del filamento para formar un denso borde de cepillo de dominios altamente cargados y no estructurados, análogo a las cerdas de un cepillo para botellas. Se ha propuesto que estos dominios de agitación entrópica definen una zona de exclusión alrededor de cada filamento, espaciando efectivamente los filamentos de sus vecinos. De esta manera, las proyecciones carboxi terminales maximizan las propiedades de relleno de espacio de los polímeros de neurofilamentos. Mediante microscopía electrónica, estos dominios aparecen como proyecciones llamadas brazos laterales que parecen estar en contacto con filamentos vecinos.
Los neurofilamentos se encuentran en las neuronas de los vertebrados en concentraciones especialmente altas en los axones, donde todos están alineados en paralelo a lo largo del eje longitudinal del axón formando una matriz que se superpone continuamente. Se ha propuesto que funcionen como estructuras de relleno de espacio que aumentan el diámetro axonal. Su contribución al diámetro del axón está determinada por la cantidad de neurofilamentos en el axón y su densidad de empaquetamiento. Se cree que el número de neurofilamentos en el axón está determinado por la expresión del gen de los neurofilamentos [7] y el transporte axonal. La densidad de empaquetado de los filamentos está determinada por sus brazos laterales que definen la separación entre los filamentos vecinos. Se cree que la fosforilación de los brazos laterales aumenta su extensibilidad, aumentando el espacio entre los filamentos vecinos [8] mediante la unión de cationes divalentes entre los brazos laterales de filamentos adyacentes [9] [10]
En las primeras etapas del desarrollo, los axones son procesos estrechos que contienen relativamente pocos neurofilamentos. Los axones que se mielinizan acumulan más neurofilamentos, lo que impulsa la expansión de su calibre. Una vez que un axón ha crecido y se ha conectado con su célula objetivo , el diámetro del axón puede aumentar hasta cinco veces. [11] Esto es causado por un aumento en el número de neurofilamentos exportados desde el cuerpo de la célula nerviosa, así como por una desaceleración de su velocidad de transporte. En los axones mielinizados maduros, los neurofilamentos pueden ser la estructura citoplasmática más abundante y pueden ocupar la mayor parte del área de la sección transversal axonal. Por ejemplo, un axón mielinizado grande puede contener miles de neurofilamentos en una sección transversal.
Además de su papel estructural en los axones, los neurofilamentos también son cargamentos de transporte axonal . [3] La mayoría de las proteínas de neurofilamentos en los axones se sintetizan en el cuerpo de las células nerviosas, donde se ensamblan rápidamente en polímeros de neurofilamentos en aproximadamente 30 minutos. [12] Estos polímeros de neurofilamentos ensamblados se transportan a lo largo del axón en pistas de microtúbulos impulsadas por proteínas motoras de microtúbulos . [13] Los filamentos se mueven bidireccionalmente, es decir, hacia la punta del axón (anterógrado) y hacia el cuerpo celular (retrógrado), pero la dirección neta es anterógrada. Los filamentos se mueven a velocidades de hasta 8 μm/s en escalas de tiempo cortas (segundos o minutos), con velocidades promedio de aproximadamente 1 μm/s. [14] Sin embargo, la velocidad promedio en escalas de tiempo más largas (horas o días) es lenta porque los movimientos son muy poco frecuentes y consisten en breves sprints interrumpidos por largas pausas. [15] [16] Por lo tanto, en escalas de tiempo largas, los neurofilamentos se mueven en el componente lento del transporte axonal.
Se han desarrollado numerosos anticuerpos específicos contra proteínas de neurofilamentos que están disponibles comercialmente. Estos anticuerpos se pueden utilizar para detectar proteínas de neurofilamentos en células y tejidos mediante microscopía de inmunofluorescencia o inmunohistoquímica . Estos anticuerpos se utilizan ampliamente para identificar neuronas y sus procesos en secciones histológicas y en cultivos de tejidos . La proteína de filamento intermedio tipo VI Nestina se expresa en neuronas y células glia en desarrollo. La nestina se considera un marcador de células madre neuronales y la presencia de esta proteína se utiliza ampliamente para definir la neurogénesis . Esta proteína se pierde a medida que avanza el desarrollo.
Los anticuerpos contra neurofilamentos también se utilizan habitualmente en neuropatología diagnóstica . La tinción con estos anticuerpos puede distinguir las neuronas (positivas para las proteínas de los neurofilamentos) de la glía (negativas para las proteínas de los neurofilamentos).
También existe un considerable interés clínico en el uso de proteínas de neurofilamentos como biomarcadores de daño axonal en enfermedades que afectan al sistema nervioso central. [17] [18] Cuando las neuronas o los axones se degeneran, las proteínas de los neurofilamentos se liberan en la sangre o el líquido cefalorraquídeo. Por tanto, los inmunoensayos de proteínas de neurofilamentos en líquido cefalorraquídeo y plasma pueden servir como indicadores de daño axonal en trastornos neurológicos. [19] Los niveles de NF-L en sangre y LCR son, por lo tanto, marcadores útiles para el seguimiento de la enfermedad en la esclerosis lateral amiotrófica , [20] la esclerosis múltiple , [21] y, más recientemente, la enfermedad de Huntington . [22] También se ha evaluado como marcador pronóstico del resultado funcional después de un accidente cerebrovascular isquémico agudo. [23] Los ratones mutantes con anomalías de los neurofilamentos tienen fenotipos que se asemejan a la esclerosis lateral amiotrófica . [24] Un trabajo reciente realizado como colaboración entre EnCor Biotechnology Inc. y la Universidad de Florida demostró que los anticuerpos NF-L empleados en los ensayos de NF-L más utilizados son específicos para formas escindidas de NF-L generadas por proteólisis inducida por muerte celular. . [25]