La N -etilmaleimida ( NEM ) es un compuesto orgánico que se deriva del ácido maleico . Contiene el grupo funcional amida , pero lo más importante es que es un alqueno que reacciona con los tioles y se usa comúnmente para modificar residuos de cisteína en proteínas y péptidos . [2]
NEM es un aceptor de Michael en la reacción de Michael , lo que significa que añade nucleófilos como los tioles. El tioéter resultante presenta un fuerte enlace CS y la reacción es prácticamente irreversible. La reacción con tioles ocurre en el rango de pH de 6,5 a 7,5, NEM puede reaccionar con aminas o sufrir hidrólisis a un pH más alcalino. NEM se ha utilizado ampliamente para investigar el papel funcional de los grupos tiol en enzimología . NEM es un inhibidor irreversible de todas las cisteína peptidasas , y la alquilación se produce en el grupo tiol del sitio activo (ver esquema). [3] [4]
NEM bloquea el transporte vesicular . En los tampones de lisis, se utilizan de 20 a 25 mM de NEM para inhibir la desumilación de proteínas para el análisis de transferencia Western . NEM también se ha utilizado como inhibidor de deubiquitinasas.
Arthur Kornberg y sus colegas utilizaron N -etilmaleimida para desactivar la ADN polimerasa III y comparar su actividad con la de la ADN polimerasa I (pol III y I, respectivamente). Kornberg había recibido el Premio Nobel por descubrir la pol I, que entonces se creía que era el mecanismo de replicación del ADN bacteriano , aunque en este experimento demostró que la pol III era la verdadera maquinaria replicativa.
NEM activa el flujo de salida de K dependiente de Cl insensible a ouabaína en glóbulos rojos de oveja y cabra con bajo contenido de K. [5] Este descubrimiento contribuyó a la identificación molecular del cotransporte K-Cl (KCC) en células embrionarias humanas transfectadas con ADNc de la isoforma KCC1, 16 años después. [6] Desde entonces, NEM se ha utilizado ampliamente como herramienta de diagnóstico para descubrir o manipular la presencia en la membrana del cotransporte K-Cl en células de muchas especies del reino animal. [7] A pesar de los repetidos intentos fallidos de identificar químicamente el grupo tiol objetivo, [8] a pH fisiológico, NEM puede formar aductos con tioles dentro de las proteínas quinasas que fosforilan KCC en residuos específicos de serina y treonina principalmente dentro del dominio C-terminal del transportador. . [9] La consiguiente desfosforilación de KCC por proteínas fosfatasas conduce a la activación de KCC. [10]