Una construcción de ADN es un segmento de ADN diseñado artificialmente transportado por un vector que puede usarse para incorporar material genético en un tejido o célula objetivo . [1] Una construcción de ADN contiene un inserto de ADN , llamado transgén , administrado a través de un vector de transformación que permite que la secuencia del inserto se replique y/o exprese en la célula diana. Este gen puede clonarse a partir de un gen natural [2] o construirse sintéticamente. [3] El vector puede administrarse mediante métodos físicos, químicos o virales. [4] Normalmente, los vectores utilizados en las construcciones de ADN contienen un origen de replicación , un sitio de clonación múltiple y un marcador seleccionable . [2] Ciertos vectores pueden portar elementos reguladores adicionales según el sistema de expresión involucrado. [5]
Las construcciones de ADN pueden ser tan pequeñas como unos pocos miles de pares de bases (kpb) de ADN que transportan un solo gen, utilizando vectores como plásmidos o bacteriófagos , o tan grandes como cientos de kpb para estudios genómicos a gran escala utilizando un cromosoma artificial. [2] Una construcción de ADN puede expresar proteínas de tipo salvaje, prevenir la expresión de ciertos genes mediante la expresión de competidores o inhibidores, o expresar proteínas mutantes, como mutaciones por deleción o mutaciones sin sentido . Las construcciones de ADN se adaptan ampliamente en la investigación de biología molecular para técnicas como la secuenciación de ADN, la expresión de proteínas y los estudios de ARN. [5]
El primer vector estandarizado, pBR220, fue diseñado en 1977 por investigadores del laboratorio de Herbert Boyer. El plásmido contiene varios sitios de enzimas de restricción y un gen estable de resistencia a los antibióticos libre de actividades de transposones. [6]
En 1982, Jeffrey Vieira y Joachim Messing describieron el desarrollo de vectores pUC derivados de M13mp7 que constan de un sitio de clonación múltiple y permiten una secuenciación y clonación más eficientes utilizando un conjunto de cebadores M13 universales. Tres años más tarde, los mismos científicos diseñaron el actualmente popular plásmido pUC19. [7]
El gen de una secuencia de ADN de interés puede clonarse a partir de una secuencia existente o desarrollarse sintéticamente. Para clonar una secuencia natural en un organismo, primero se corta el ADN del organismo con enzimas de restricción , que reconocen secuencias de ADN y las cortan alrededor del gen objetivo. Luego, el gen se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Normalmente, este proceso incluye el uso de secuencias cortas conocidas como cebadores para hibridar inicialmente con la secuencia objetivo; además, se pueden introducir mutaciones puntuales en las secuencias del cebador y luego copiarlas en cada ciclo para modificar la secuencia diana. [2]
También es posible sintetizar una cadena de ADN diana para una construcción de ADN. Se pueden desarrollar hebras cortas de ADN conocidas como oligonucleótidos mediante síntesis basada en columnas, en la que se añaden bases una por una a una hebra de ADN unida a una fase sólida. Cada base tiene un grupo protector para evitar que el enlace no se elimine hasta que la siguiente base esté lista para agregarse, lo que garantiza que estén enlazados en la secuencia correcta. Los oligonucleótidos también se pueden sintetizar en un microarray, lo que permite sintetizar decenas de miles de secuencias a la vez, para reducir costos. [3] Para sintetizar un gen más grande, se desarrollan oligonucleótidos con secuencias superpuestas en los extremos y luego se unen. El método más común se llama ensamblaje cíclico de la polimerasa (PCA): los fragmentos se hibridan en las regiones superpuestas y se extienden, y en cada ciclo se crean fragmentos más grandes. [2]
Una vez aislada una secuencia, se debe insertar en un vector . La forma más sencilla de hacerlo es cortar el ADN del vector utilizando enzimas de restricción; Si se usaron las mismas enzimas para aislar la secuencia objetivo, entonces se crearán las mismas secuencias "sobresalientes" en cada extremo, lo que permitirá la hibridación. Una vez que el gen diana se ha hibridado con el ADN del vector, se pueden unir utilizando una ADN ligasa . [2] Una estrategia alternativa utiliza la recombinación entre sitios homólogos en el gen diana y la secuencia del vector, eliminando la necesidad de enzimas de restricción. [8]
Hay tres categorías generales de entrega de construcciones de ADN: física, química y viral. [4] Los métodos físicos, que administran el ADN mediante la penetración física de la célula, incluyen la microinyección , la electroporación y la biolística . [9] Los métodos químicos se basan en reacciones químicas para entregar el ADN e incluyen la transformación con células que se vuelven competentes usando fosfato de calcio, así como la entrega a través de nanopartículas lipídicas. [10] [11] Los métodos virales utilizan una variedad de vectores virales para administrar el ADN, incluidos adenovirus , lentivirus y virus del herpes simple [12]
Además del gen diana, hay tres elementos importantes en un vector: un origen de replicación, un marcador seleccionable y un sitio de clonación múltiple. Un origen de replicación es una secuencia de ADN que inicia el proceso de replicación del ADN, permitiendo que el vector se clone a sí mismo. Un sitio de clonación múltiple contiene sitios de unión para varias enzimas de restricción, lo que facilita la inserción de diferentes secuencias de ADN en el vector. Un marcador seleccionable confiere algún rasgo que puede seleccionarse fácilmente en una célula huésped, de modo que pueda determinarse si la transformación fue exitosa. Los marcadores seleccionables más comunes son genes de resistencia a los antibióticos, de modo que las células huésped sin la construcción morirán cuando se expongan al anticuerpo y solo quedarán las células huésped con la construcción. [2]
Se pueden utilizar construcciones de ADN para producir proteínas, incluidas tanto proteínas naturales como proteínas mutantes diseñadas. Estas proteínas se pueden utilizar para fabricar productos terapéuticos, como productos farmacéuticos y anticuerpos. Las construcciones de ADN también pueden cambiar los niveles de expresión de otros genes al expresar secuencias reguladoras como promotores e inhibidores. Además, las construcciones de ADN se pueden utilizar para investigaciones como la creación de bibliotecas genómicas, la secuenciación de ADN clonado y el estudio de la expresión de ARN y proteínas. [5]