La zimografía es una técnica electroforética para la detección de enzimas hidrolíticas , basada en el repertorio de sustratos de la enzima. Se utilizan tres tipos de zimografía; en zimografía en gel, zimografía in situ y zimografía in vivo . [2] Por ejemplo, la gelatina incrustada en un gel de poliacrilamida será digerida por gelatinasas activas que recorren el gel. Después de la tinción de Coomassie , las áreas de degradación son visibles como bandas claras sobre un fondo teñido de oscuro. [3]
El uso moderno del término zimografía se ha adaptado para definir el estudio y la catalogación de productos fermentados, como la cerveza o el vino, a menudo por cerveceros o enólogos específicos o dentro de una categoría identificada de fermentación, como con una cepa particular de levadura o especie de bacteria. . [ cita necesaria ] Zimografía también se refiere a una colección de productos fermentados relacionados, considerados como un cuerpo de trabajo. Por ejemplo, todas las cervezas producidas por una cervecería en particular podrían denominarse colectivamente su zimografía. [ cita necesaria ]
Véase también Zimología o la ciencia aplicada de la zimografía. La zimología se relaciona con los procesos bioquímicos de la fermentación, especialmente la selección de levaduras y bacterias fermentadoras en la elaboración de cerveza, vinificación y otros alimentos fermentados. Por ejemplo, la elaboración de cerveza implica la aplicación de levadura de fermentación superior (ale) o inferior (lager) para producir la variedad deseada de cerveza. La síntesis de la levadura puede afectar el perfil de sabor de la cerveza, es decir, diacetilo (sabor o aroma a mantequilla, caramelo).
Las muestras se preparan en un tampón de carga estándar no reductor para SDS-PAGE . No es necesario ningún agente reductor ni ebullición, ya que interferirían con el replegamiento de la enzima. Se embebe un sustrato adecuado (por ejemplo, gelatina o caseína para la detección de proteasas) en el gel de resolución durante la preparación del gel de acrilamida . Después de la electroforesis , el SDS se elimina del gel (o zimograma ) mediante incubación en Triton X-100 sin tampón , seguido de incubación en un tampón de digestión apropiado, durante un período de tiempo optimizado a 37 °C. Posteriormente, el zimograma se tiñe (comúnmente con negro Amido o azul brillante Coomassie ) y las áreas de digestión aparecen como bandas claras sobre un fondo teñido de oscuro donde la enzima ha degradado el sustrato.
El protocolo estándar puede requerir modificaciones según la enzima de la muestra; por ejemplo, las glicosidasas digestivas de D. melanogaster generalmente sobreviven a condiciones reductoras (es decir, la presencia de 2-mercaptoetanol o DTT ) y, hasta cierto punto, al calentamiento. De hecho, las separaciones después del calentamiento a 50 °C tienden a presentar un aumento sustancial en la resolución de la banda, sin una pérdida apreciable de actividad. [4] [5]
Un protocolo común utilizado en el pasado para la zimografía de la actividad de la α-amilasa fue el llamado protocolo de película de almidón de WW Doane. Aquí se ejecutó un gel PAGE nativo para separar las proteínas en un homogeneizado. Posteriormente, se superpuso durante un período de tiempo un gel fino con almidón disuelto (o más propiamente suspendido) sobre el gel original. [6] Luego, el almidón se tiñó con yodo de Lugol.
La zimografía en gel se utiliza a menudo para la detección y análisis de enzimas producidas por microorganismos. [7] Esto ha dado lugar a variaciones en el protocolo estándar, por ejemplo, la zimografía de sustrato mixto. [2]
La zimografía inversa copolimeriza tanto el sustrato como la enzima con la acrilamida y es útil para demostrar la actividad inhibidora de la enzima . Después de la tinción, las áreas de inhibición se visualizan como bandas oscuras sobre un fondo claro (o ligeramente teñido).
En la técnica de impresión, la enzima se separa mediante electroforesis en gel nativo y el gel se coloca sobre un sustrato tratado con agarosa . [1]
La zimografía también se puede aplicar a otros tipos de enzimas, incluidas las xilanasas , lipasas y quitinasas.