La uracil-ADN glicosilasa (también conocida como UNG o UDG ) es una enzima. Su función más importante es prevenir la mutagénesis eliminando el uracilo de las moléculas de ADN mediante la escisión del enlace N-glucosídico e iniciando la vía de reparación por escisión de bases (BER).
El gen humano codifica una de varias uracilo-ADN glicosilasas. El uso de promotores alternativos y el empalme de este gen conducen a dos isoformas diferentes: la UNG1 mitocondrial y la UNG2 nuclear. [5] Una función importante de las uracilo-ADN glicosilasas es prevenir la mutagénesis eliminando el uracilo de las moléculas de ADN mediante la escisión del enlace N-glucosídico e iniciando la vía de reparación por escisión de bases (BER). Las bases de uracilo se producen por desaminación de citosina o incorporación errónea de residuos de dUMP . Después de que ocurre una mutación, la amenaza mutagénica del uracilo se propaga a través de cualquier paso posterior de replicación del ADN . [6] Una vez descomprimidos, los pares de guanina y uracilo no coincidentes se separan y la ADN polimerasa inserta bases complementarias para formar un par de guanina-citosina (GC) en una cadena hija y un par de adenina -uracilo (AU) en la otra. [7] La mitad de todo el ADN de la progenie derivado de la plantilla mutada hereda un cambio de GC a AU en el sitio de mutación. [7] UDG elimina el uracilo en los pares AU y GU para evitar la propagación de la falta de coincidencia de bases en los procesos de transcripción y traducción posteriores . [7] Con alta eficiencia y especificidad, esta glicosilasa repara entre 100 y 500 bases dañadas diariamente en la célula humana. [8] Las células humanas expresan de cinco a seis tipos de ADN glicosilasas , todas las cuales comparten un mecanismo común de eversión y escisión de bases como medio de reparación del ADN. [9]
UDG está hecho de una hoja β paralela de cuatro hebras rodeada por ocho hélices α . [10] El sitio activo comprende cinco motivos altamente conservados que catalizan colectivamente la escisión del enlace glicosídico : [11] [12]
La escisión del enlace glicosídico sigue un mecanismo de "pellizcar-empujar-tirar" utilizando los cinco motivos conservados. [10]
Pellizcar : UDG escanea el ADN en busca de uracilo uniéndose de forma no específica a la cadena y creando una torcedura en la columna vertebral, posicionando así la base seleccionada para la detección. Los bucles Pro-rich y Gly-Ser forman contactos polares con los fosfatos 3' y 5' que flanquean la base examinada. [11] Esta compresión de la columna vertebral del ADN , o "pellizco", permite un contacto estrecho entre UDG y la base de interés. [10]
Empujar : para evaluar completamente la identidad del nucleótido, el bucle de intercalación penetra o empuja el surco menor del ADN e induce un cambio conformacional para sacar el nucleótido de la hélice. [13] La compresión de la columna vertebral favorece la eversión del nucleótido ahora extrahelicoidal, que está posicionado para ser reconocido por el motivo de unión de uracilo. [10] El acoplamiento de la intercalación y la eversión ayuda a compensar la interrupción de las interacciones favorables de apilamiento de bases dentro de la hélice del ADN. Leu 272 llena el vacío dejado por el nucleótido invertido para crear interacciones de dispersión con bases vecinas y restaurar la estabilidad del apilamiento. [11]
Tirar : ahora accesible al sitio activo, el nucleótido interactúa con el motivo de unión de uracilo. La forma del sitio activo complementa la estructura evertida del uracilo, lo que permite una alta especificidad de sustrato. Las purinas son demasiado grandes para caber en el sitio activo, mientras que las interacciones desfavorables con otras pirimidinas desalientan la unión de sustratos alternativos. [9] La cadena lateral de Tyr 147 interfiere estéricamente con el grupo metilo C5 de timina , mientras que un enlace de hidrógeno específico entre el uracilo O2 carbonilo y Gln 144 discrimina contra un sustrato de citosina, que carece del carbonilo necesario. [9] Una vez que se reconoce el uracilo, la escisión del enlace glicosídico se produce según el mecanismo siguiente.
La posición de los residuos que activan el nucleófilo del agua y protonan el grupo saliente del uracilo es ampliamente debatida, aunque el mecanismo más comúnmente seguido emplea el bucle de activación del agua detallado en la estructura de la enzima. [12] [14] Independientemente de la posición, las identidades de los residuos de ácido aspártico y histidina son consistentes en todos los estudios catalíticos. [10] [11] [12] [14] [15]
La uracil N -glicosilasa (UNG) se utiliza para eliminar los productos remanentes de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la PCR. Este método modifica los productos de PCR de modo que en una nueva reacción, cualquier producto residual de amplificaciones de PCR anteriores se digiere y se evita que se amplifique, pero las verdaderas plantillas de ADN no se verán afectadas. [16] La PCR sintetiza abundantes productos de amplificación en cada ronda, pero la contaminación de rondas posteriores de PCR con trazas de estos productos, denominada contaminación por arrastre, produce resultados falsos positivos. La contaminación por arrastre de alguna PCR anterior puede ser un problema importante, debido tanto a la abundancia de productos de la PCR como a la estructura ideal del material contaminante para la reamplificación. Sin embargo, la contaminación por arrastre se puede controlar mediante los dos pasos siguientes: (i) incorporar dUTP en todos los productos de PCR (sustituyendo dUTP por dTTP o incorporando uracilo durante la síntesis de cebadores; y (ii) tratando todas las reacciones iniciales posteriores completamente preensambladas. con uracilo ADN glicosilasa (UDG), seguido de inactivación térmica de UDG. UDG escinde la base de uracilo de la columna vertebral de fosfodiéster del ADN que contiene uracilo, pero no tiene ningún efecto sobre el ADN natural (es decir, que contiene timina). Los sitios apirimidínicos resultantes bloquean replicación por ADN polimerasas, y son muy lábiles a la hidrólisis ácido/base. Debido a que UDG no reacciona con dTTP y también se inactiva mediante desnaturalización por calor antes de la PCR real, la contaminación por arrastre de las PCR se puede controlar de manera efectiva si los contaminantes contienen uracilos en lugar de timinas [6]
La uracil N -glicosilasa también se utilizó en un estudio para detectar evidencia de actividad metabólica continua de bajo nivel y reparación del ADN en bacterias antiguas. [17] La supervivencia a largo plazo de las bacterias puede ocurrir ya sea mediante la formación de endosporas (en la cual la bacteria entra en letargo total, sin ninguna actividad metabólica y, por lo tanto, sin reparación del ADN), o mediante la reducción de la actividad metabólica a una tasa muy baja, suficiente para llevar a cabo la reparación continua del ADN y evitar el agotamiento de otras moléculas inestables (como el ATP ), en el que el microbio puede reparar el daño a su ADN pero también continúa consumiendo nutrientes lentamente. [17] Las secuencias de ADN de bacterias del permafrost se amplificaron mediante PCR. Una serie de ejecuciones amplificó las secuencias de ADN tal cual (para detectar todo el ADN bacteriano vivo en las muestras), mientras que la otra serie buscó específicamente ADN que había estado en reparación continua; para ello, el ADN fue tratado con UNG para eliminar los uracilos. Esto impidió la amplificación del ADN no reparado de dos maneras: en primer lugar, los sitios abásicos generados por la eliminación de uracilos impidieron que la ADN polimerasa utilizada en la PCR pasara más allá del sitio dañado, mientras que estos sitios abásicos también debilitaron directamente el ADN y lo hicieron más probable. fragmentarse al calentarse. [17] De esta manera, los investigadores pudieron mostrar evidencia de reparación continua del ADN en bacterias Gram-positivas con alto GC de hasta 600.000 años de antigüedad. [17]
La uracil N glicosilasa también se ha utilizado en un método para la clonación de fragmentos de ADN amplificados por PCR. En este método, los cebadores utilizados en la PCR se sintetizan con residuos de uracilo en lugar de timina. Cuando estos cebadores se incorporan en fragmentos amplificados por PCR, la secuencia del cebador se vuelve susceptible a la digestión con uracilo N glicosilasa y produce extremos 3' que sobresalen y que se pueden hibridar con un ADN vector preparado apropiadamente. Las moléculas quiméricas resultantes se pueden transformar en células competentes con alta eficiencia, sin necesidad de ligación in vitro. [18]
Se ha demostrado que la uracil-ADN glicosilasa interactúa con RPA2 . [19]
