La sonoporación , o sonicación celular , es el uso de sonido en el rango ultrasónico para aumentar la permeabilidad de la membrana plasmática celular . Esta técnica se utiliza habitualmente en biología molecular y terapia génica no viral para permitir la absorción de moléculas grandes, como el ADN , en la célula, en un proceso de alteración celular llamado transfección o transformación . La sonoporación emplea la cavitación acústica de microburbujas para mejorar la entrega de estas grandes moléculas. [1] El mecanismo exacto de la translocación de membrana mediada por la sonoporación aún no está claro, y actualmente se están explorando algunas hipótesis diferentes.
La sonoporación se está estudiando activamente para la introducción de genes extraños en células de cultivos de tejidos, especialmente células de mamíferos . La sonoporación también se está estudiando para su uso en terapia genética dirigida in vivo , en un escenario de tratamiento médico en el que a un paciente se le administra ADN modificado y un transductor ultrasónico podría dirigir este ADN modificado a regiones específicas del cuerpo del paciente. [2] La bioactividad de esta técnica es similar a la electroporación y, en algunos casos, superior a ella . Se ha demostrado que la exposición prolongada a ultrasonidos de baja frecuencia (< MHz ) produce una muerte celular completa (ruptura), por lo que también se debe tener en cuenta la viabilidad celular al emplear esta técnica.
La sonoporación se realiza con un sonoporador exclusivo. La sonoporación también se puede realizar con transductores piezoeléctricos personalizados conectados a generadores de funciones de mesa y amplificadores acústicos. En algunas aplicaciones también se pueden utilizar dispositivos médicos de ultrasonido estándar .
La medición de la acústica utilizada en la sonoporación se enumera en términos de índice mecánico , que cuantifica la probabilidad de que la exposición a ultrasonidos de diagnóstico produzca un efecto biológico adverso por una acción no térmica basada en la presión. [3]
Los agentes de contraste de microburbujas se utilizan generalmente en aplicaciones de ultrasonido con contraste mejorado para mejorar el impacto acústico del ultrasonido. Específicamente para la sonoporación, se utilizan microburbujas para mejorar significativamente la translocación de la membrana de la terapéutica molecular. [4]
Las microburbujas que se utilizan hoy en día están compuestas por un núcleo de gas y una capa circundante. La composición de estos elementos puede variar según las propiedades físicas y químicas preferidas. [5] Se han formado envolturas de microburbujas con lípidos , galactosa , albúmina o polímeros . El núcleo de gas puede estar formado por aire o gases pesados como nitrógeno o perfluorocarbono . [6]
Los núcleos de gas de microburbujas tienen una alta compresibilidad en relación con su entorno líquido, lo que los hace muy sensibles a las aplicaciones acústicas. Como resultado de la estimulación ultrasónica, las microburbujas sufren expansión y contracción, un fenómeno llamado cavitación estable . Si se une una microburbuja a la membrana celular , las oscilaciones de la microburbuja producidas por la estimulación ultrasónica pueden empujar y tirar de la membrana para producir una abertura de la membrana. Estas rápidas oscilaciones también son responsables del flujo de fluido adyacente llamado microstreaming, que aumenta la presión sobre las células circundantes produciendo una mayor sonoporación en poblaciones celulares completas. [7] Los mecanismos físicos supuestamente involucrados con la sonoporación mejorada con microburbujas se han denominado empujar, tirar, microcorriente, traducción y chorro. [8]
El mecanismo por el cual las moléculas cruzan las barreras de las membranas celulares durante la sonoporación aún no está claro. Existen diferentes teorías que potencialmente pueden explicar la permeabilización de la barrera y la entrega molecular. Las hipótesis dominantes incluyen la formación de poros, la endocitosis y las heridas de las membranas.
La formación de poros después de la aplicación de ultrasonido se informó por primera vez en 1999 en un estudio que observó cráteres en las membranas celulares después de la aplicación de ultrasonido a 255 kHz. [9] Posteriormente, la microinyección de moléculas de dextrano mediada por sonoporación mostró que los mecanismos de permeabilidad de la membrana difieren según el tamaño de las moléculas de dextrano. Se informó que la microinyección de moléculas de dextrano de 3 a 70 kDa atravesó la membrana celular a través de poros transitorios. Por el contrario, las moléculas de dextrano de 155 y 500 kDa se encontraron predominantemente en estructuras similares a vesículas, lo que probablemente indica el mecanismo de endocitosis . [10] Esta variabilidad en el comportamiento de la membrana ha llevado a otros estudios que investigan la ruptura de la membrana y las características de resellado dependiendo de la amplitud y duración del ultrasonido.
Varias reacciones celulares a los ultrasonidos indican el mecanismo de captación molecular mediante endocitosis. Estos fenómenos reaccionarios observados incluyen el intercambio iónico , el peróxido de hidrógeno y la concentración de calcio intracelular en las células. Los estudios han utilizado técnicas de pinzamiento de parches para monitorear el intercambio iónico potencial de membrana para determinar el papel de la endocitosis en la sonoporación. Se demostró que la aplicación de ultrasonido a las células y las microburbujas adyacentes produce una marcada hiperpolarización de la membrana celular junto con un aumento progresivo del calcio intracelular, que se cree que es una consecuencia de la apertura de los canales de calcio en respuesta a las oscilaciones de las microburbujas. Estos hallazgos actúan como respaldo para la aplicación de ultrasonido que induce el descubrimiento mediado por calcio de las fosas recubiertas de clatrina que se observa en las vías tradicionales de endocitosis. [11] [12] Otro trabajo informó que la sonoporación indujo la formación de peróxido de hidrógeno, una reacción celular que también se sabe que está involucrada con la endocitosis. [9]
Se han observado heridas creadas mecánicamente en la membrana plasmática como resultado de fuerzas de corte producidas por sonoporación . La naturaleza de estas heridas puede variar según el grado de cavitación acústica que conduce a un espectro de comportamiento celular, desde la formación de ampollas en la membrana hasta la lisis celular instantánea . Múltiples estudios que examinan heridas de membrana observan un comportamiento de resellado, un proceso que depende del reclutamiento de ATP y vesículas intracelulares. [9]
Después de la permeabilización de la membrana mediada por la sonoporación, las células pueden reparar automáticamente las aberturas de la membrana mediante un fenómeno llamado "sonoporación reparable". [13] Se ha demostrado que el proceso de resellado de la membrana depende del calcio. Esta propiedad puede sugerir que el proceso de reparación de la membrana implica un mecanismo de reparación activo de una célula en respuesta al influjo celular de calcio. [14]
El primer estudio que informó la administración molecular mediante ultrasonido fue un estudio in vitro de 1987 que intentaba transferir ADN plasmídico a células de fibroblastos de ratón cultivadas mediante sonoporación. [15] Esta exitosa transfección de ADN plasmídico que confiere resistencia al antibiótico G418 finalmente condujo a más estudios in vitro que insinuaron el potencial de transfección por sonoporación de ADN plasmídico y ARNip in vivo.
La administración de fármacos in vivo mediada por ultrasonido se informó por primera vez en 1991 [15] y han seguido muchos otros estudios preclínicos que involucran la sonoporación. Este método se utiliza para administrar fármacos terapéuticos o genes para tratar una variedad de enfermedades que incluyen: accidente cerebrovascular , cáncer , Parkinson , Alzheimer ... [13] La utilidad preclínica de la sonoporación está bien ilustrada a través de tratamientos de radiación tumoral anteriores que han informado una mayor La destrucción celular es diez veces mayor cuando la radiación ionizante se combina con una alteración vascular de microburbujas mediada por ultrasonido. Este aumento en la eficiencia de la administración podría permitir la reducción adecuada de la dosis terapéutica. [dieciséis]