La resazurina (7-hidroxi-3H - fenoxazin-3-ona 10-óxido) es un tinte de fenoxazina que es débilmente fluorescente , no tóxico , permeable a las células y sensible al redox. [2] [3] La resazurina tiene un color de azul a púrpura por encima de pH 6,5 y un color naranja por debajo de pH 3,8. [4] Se utiliza en ensayos microbiológicos , celulares y enzimáticos porque puede reducirse irreversiblemente a la resorufina de color rosa y altamente fluorescente (7-hidroxi-3H- fenoxazin -3-ona). A pH circuneutral, la resorufina se puede detectar mediante observación visual de su color rosa o mediante fluorimetría , con un máximo de excitación a 530-570 nm y un máximo de emisión a 580-590 nm. [5]
Cuando una solución que contiene resorufina se somete a condiciones reductoras (E h < -110 mV), casi toda la resorufina se reduce reversiblemente a la dihidroresorufina translúcida no fluorescente (también conocida como hidroresorufina) y la solución se vuelve translúcida (el potencial redox de la resorufina /dihidroresorufina es -51 mV frente al electrodo de hidrógeno estándar a pH 7,0). Cuando se aumenta el E h de esta misma solución, la dihidroresorufina se oxida nuevamente a resorufina, y esta reacción reversible se puede usar para monitorear si el potencial redox de un medio de cultivo permanece en un nivel suficientemente bajo para los organismos anaeróbicos .
La solución de resazurina tiene uno de los valores más altos conocidos del índice de dicromaticidad de Kreft . [6] Esto significa que tiene un gran cambio en el tono de color percibido cuando el espesor o la concentración de la muestra observada aumenta o disminuye.
Por lo general, la resazurina está disponible comercialmente como sal de sodio .
Aplicaciones de viabilidad celular.
La resazurina se reduce a resorufina mediante la respiración aeróbica de células metabólicamente activas y puede utilizarse como indicador de la viabilidad celular. Pesch y Simmert lo utilizaron por primera vez para cuantificar el contenido bacteriano en la leche en 1929. [7] Puede usarse para detectar la presencia de células viables en cultivos de células de mamíferos. [8] Se introdujo comercialmente inicialmente bajo la marca registrada Alamar Blue (Trek Diagnostic Systems, Inc), y ahora también está disponible con otros nombres como ensayo AB, Vybrant ( Molecular Probes ) y UptiBlue ( Interchim ).
Los ensayos basados en resazurina muestran una excelente correlación con los ensayos de viabilidad de referencia, como los ensayos basados en formazán ( MTT /XTT) y las técnicas basadas en timidina tritiada. [9] [10] La baja toxicidad lo hace adecuado para estudios más prolongados y se ha aplicado a células animales, bacterias y hongos [10] para ensayos de cultivos celulares como recuento de células, supervivencia y proliferación celular . [11] En los ensayos antimicrobianos, la resazurina se utiliza comúnmente para evaluar la concentración inhibidora mínima (MIC) o la concentración bactericida mínima (MBC) de agentes antimicrobianos . [12]
Para reemplazar un ensayo estándar de vivo/muerto, la resazurina también se puede multiplexar con ensayos quimioluminiscentes, como ensayos de citocinas, ensayos de caspasas para medir la apoptosis o ensayos indicadores para medir la expresión de un gen o una proteína. [10]
La reacción irreversible de resazurina a resorufina es proporcional a la respiración aeróbica. [13]
Resazurina como ensayo colorimétrico para la viabilidad celular.
La resazurina se utiliza como ensayo fluorescente para determinar la viabilidad celular. La resazurina no emite fluorescencia cuando se expone a la luz verde.
Resazurina como ensayo fluorescente para la viabilidad celular: la resorufina fluoresce cuando se expone a luz verde
Prueba de reducción de resazurina
La resazurina se puede utilizar como parte de una serie de pruebas rápidas para determinar la calidad de una muestra de leche. En esta prueba, se agrega resazurina como un tinte redox violeta que se vuelve rosa malva debido a la conversión en resorufina y luego en dihidroresorufina incolora. Esto sucede debido a la disminución del potencial de oxidación-reducción en la muestra de leche causada por la presencia de bacterias que utilizan el oxígeno disponible presente en la leche para la respiración aeróbica . La velocidad del cambio de color se utiliza como índice del número de bacterias presentes en la muestra de leche. [14]
Otras aplicaciones
Reducción de resazurina a resorufina y reducción reversible de resorufina a dihidroresorufina.
Por lo general, en presencia de NADPH deshidrogenasa o NADH deshidrogenasa como enzima, NADPH o NADH es el reductor que convierte la resazurina en resorufina. Por lo tanto, el sistema resazurina/diaforasa/NADPH se puede utilizar para detectar el nivel de NADH, NADPH o diaforasa, y cualquier actividad bioquímica o enzimática que esté implicada en una reacción bioquímica que genere NADH o NADPH. [15] [16] [17] [18] [19]
La resazurina se puede utilizar para analizar el L-glutamato , logrando una sensibilidad de 2,0 pmol por pocillo en una placa de 96 pocillos. [20]
La resazurina también se puede utilizar para medir la biodegradación aeróbica de la materia orgánica que se encuentra en los efluentes. [21]
La resazurina se utiliza para medir la cantidad de respiración aeróbica en los arroyos. [22] Dado que la mayor parte de la respiración aeróbica ocurre en el lecho del arroyo, la conversión de resazurina en resorufina también es una medida de la cantidad de intercambio entre la columna de agua y el lecho del arroyo.
Síntesis
La resazurina se prepara mediante condensación catalizada por ácido entre resorcinol y 4-nitrosoresorcinol seguida de oxidación del intermedio con óxido de manganeso (IV) :
Síntesis de resazurina
El tratamiento del producto de reacción bruto con exceso de carbonato de sodio produce la sal sódica de resazurina, que suele ser la forma comercial del colorante. Es posible realizar la etapa de condensación en alcoholes, pero da como resultado rendimientos más bajos del producto; en agua pura o ácido acético la reacción no transcurre satisfactoriamente. [23]
Tintes relacionados
La 10-acetil-3,7-dihidroxifenoxazina (también conocida como Amplex Red), estructuralmente relacionada con la resazurina, reacciona con H 2 O 2 en una estequiometría 1:1 para producir el mismo subproducto resorufina (utilizado en muchos ensayos que combinan, por ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRP), o NADH, NADPH utilizando enzimas). [24] [25]
1,3-dicloro-7-hidroxi-9,9-dimetilacridin-2(9 H )-ona (tinte DDAO), un tinte fluorescente utilizado para el marcaje de oligonucleótidos. [28]
Referencias
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