La microdisección por captura láser ( LCM ), también llamada microdisección , microdisección láser ( LMD ) o microdisección asistida por láser ( LMD o LAM ), es un método para aislar células específicas de interés de regiones microscópicas de tejido /células/ organismos [1] [2] ( disección a escala microscópica con la ayuda de un láser ).
La microdisección por captura láser (LCM) es un método para obtener subpoblaciones de células tisulares bajo visualización microscópica directa. La tecnología LCM puede recolectar las células de interés directamente o puede aislar células específicas cortando células no deseadas para dar poblaciones celulares enriquecidas histológicamente puras. Existe una variedad de aplicaciones posteriores: genotipado de ADN y análisis de pérdida de heterocigosidad (LOH), perfil de transcripción de ARN , generación de bibliotecas de ADNc , descubrimiento proteómico y perfil de vías de señalización. El tiempo total requerido para llevar a cabo este protocolo es típicamente de 1 a 1,5 h. [3]
Se acopla un láser a un microscopio y se enfoca sobre el tejido en el portaobjetos. Mediante el movimiento del láser por medio de la óptica o la platina, el foco sigue una trayectoria predefinida por el usuario. Esta trayectoria, también llamada elemento , se corta y se separa del tejido adyacente. Después del proceso de corte, debe seguir un proceso de extracción si se desea realizar un proceso de extracción. Las tecnologías más recientes utilizan la microdisección sin contacto.
Existen varias formas de extraer tejido de un portaobjetos de microscopio con una muestra de histopatología . Presione una superficie pegajosa sobre la muestra y desgarre. Esto extrae la región deseada, pero también puede eliminar partículas o tejido no deseado de la superficie, porque la superficie no es selectiva. Derrita una membrana de plástico sobre la muestra y desgarre. El calor se aplica, por ejemplo, mediante un láser rojo o infrarrojo (IR) sobre una membrana teñida con un colorante absorbente. A medida que esto adhiere la muestra deseada a la membrana, como ocurre con cualquier membrana que se coloca cerca de la superficie de la muestra de histopatología, es posible que se extraigan algunos restos. Otro peligro es el calor introducido: algunas moléculas como el ADN, el ARN o las proteínas no se pueden calentar demasiado o no se pueden calentar en absoluto con el objetivo de aislarlas de la forma más pura posible.
Para el transporte sin contacto. Existen tres métodos diferentes. El transporte por gravedad utilizando un microscopio vertical (llamado GAM, microdisección asistida por gravedad ) o el transporte por catapulta de presión láser ; la generación más reciente utiliza una tecnología basada en transferencia hacia adelante inducida por láser (LIFT). Con el corte y captura, se coloca una tapa recubierta con un adhesivo directamente sobre la sección de tejido finamente cortada (5-8 μm), la sección misma descansa sobre una membrana fina (naftaleno de polietileno). Un láser IR calienta suavemente el adhesivo en la tapa fusionándolo con el tejido subyacente y un láser UV corta a través del tejido y la membrana subyacente. La entidad de membrana-tejido ahora se adhiere a la tapa y las células en la tapa se pueden utilizar en aplicaciones posteriores (análisis de ADN, ARN, proteínas). [4]
Bajo un microscopio que utiliza una interfaz de software, se observa una sección de tejido (normalmente de 5 a 50 micrómetros de espesor) y se identifican células individuales o grupos de células, ya sea de forma manual o de forma semiautomática o más automatizada, lo que permite la obtención de imágenes y la posterior selección automática de objetivos para el aislamiento. Actualmente existen seis tecnologías principales de aislamiento/recolección que utilizan un microscopio y un dispositivo para el aislamiento de células. Cuatro de ellas utilizan normalmente un láser pulsado ultravioleta (355 nm) para el corte de los tejidos directamente o de las membranas/películas, y a veces en combinación con un láser IR responsable de calentar/fundir un polímero pegajoso para la adhesión y el aislamiento celular. El láser IR proporciona un enfoque más suave para la microdisección. Una quinta tecnología basada en láser ultravioleta utiliza portaobjetos especiales recubiertos con un revestimiento de transferencia de energía que, cuando se activa con el pulso láser, impulsa el tejido o las células hacia una tapa de recolección.
El ancho de corte del láser suele ser inferior a 1 μm, por lo que las células objetivo no se ven afectadas por el haz láser. Incluso las células vivas no se dañan por el corte láser y son viables después del corte para la clonación y el recultivo según corresponda. [5]
Las distintas tecnologías difieren en el proceso de recolección, los métodos de obtención de imágenes posibles ( microscopía de fluorescencia , microscopía de campo claro , microscopía de contraste de interferencia diferencial , microscopía de contraste de fase , etc.) y los tipos de soportes y preparación de tejido necesarios antes de la obtención de imágenes y el aislamiento. La mayoría son principalmente sistemas dedicados a la microdisección, y algunos también se pueden utilizar como microscopios de investigación; solo una tecnología (la n.° 2 aquí, Leica) utiliza un microscopio vertical, lo que limita un poco algunas de las capacidades de manipulación de muestras, especialmente para el trabajo con células vivas.
La primera tecnología (utilizada por Carl Zeiss PALM) corta alrededor de la muestra y luego la recoge mediante una tecnología de "catapultado". La muestra puede catapultarse desde un portaobjetos o una placa de cultivo especial mediante un pulso láser UV desenfocado que genera una fuerza fotónica para impulsar el material fuera del portaobjetos/placa, una técnica a veces llamada catapultado por presión de microdisección láser (LMPC). El material diseccionado se envía hacia arriba (hasta varios milímetros) a una tapa de tubo de microcentrífuga u otro colector que contiene un tampón o un material pegajoso especializado en la tapa del tubo al que se adherirá el tejido. Este proceso de catapultado activo evita algunos de los problemas estáticos que se producen al utilizar portaobjetos recubiertos con membrana. [6]
Otro proceso sigue el método de microdisección asistida por gravedad que activa la gravedad para recolectar muestras en la tapa del tubo debajo del portaobjetos utilizado (utilizado por el sistema ION LMD , Jungwoo F&B). En el caso de este sistema, mueve la platina motorizada para cortar las células de interés, manteniendo fijo el rayo láser. Y el sistema utiliza un láser de estado sólido de 355 nm ( UV-A ), que es la forma más segura de cortar los tejidos sin dañar el ARN o el ADN. [7] [ verificación fallida ]
Otro proceso LCM estrechamente relacionado (utilizado por Leica) corta la muestra desde arriba y la muestra cae por gravedad (microdisección asistida por gravedad) en un dispositivo de captura debajo de la muestra. [8] La diferencia con el proceso superior es que el rayo láser aquí se mueve para cortar el tejido moviendo un espejo dicroico.
Cuando las células (en un portaobjetos o placa de cultivo especial) de elección están en el centro del campo de visión, el operador selecciona las células de interés utilizando el software del instrumento. El área que se va a aislar se activa con un láser de infrarrojo cercano para activar la película de transferencia en una tapa colocada sobre la muestra de tejido, derritiendo el adhesivo que luego fusiona la película con las células subyacentes de elección (consulte los sistemas Arcturus); y/o activando un láser UV para cortar la célula de interés. Luego, las células se separan de la sección delgada de tejido, dejando atrás todas las células no deseadas. Luego, las células de interés se visualizan y documentan antes de la extracción. [9]
La cuarta tecnología basada en UV (utilizada por Molecular Machines and Industries AG) ofrece una ligera diferencia con respecto a la tercera tecnología, ya que crea esencialmente una especie de sándwich con portaobjetos>muestra>y membrana recubriendo la muestra mediante el uso de un portaobjetos con marco cuya superficie de membrana es cortada por el láser y finalmente recogida desde arriba por una tapa adhesiva especial. [10]
Una quinta tecnología basada en rayos ultravioleta utiliza portaobjetos de vidrio estándar recubiertos con un revestimiento de transferencia de energía inerte y un sistema de microdisección láser basado en rayos ultravioleta (normalmente una máquina Leica LMD o PALM Zeiss). Las secciones de tejido se montan sobre el revestimiento de transferencia de energía. La energía de un láser ultravioleta se convierte en energía cinética al chocar con el revestimiento, vaporizándolo e impulsando instantáneamente las características del tejido seleccionado hacia el tubo de recolección. Los portaobjetos recubiertos con transferencia de energía, comercializados bajo el nombre comercial DIRECTOR slides por Expression Pathology Inc. (Rockville, MD), ofrecen varias ventajas para el trabajo proteómico. Tampoco son autofluorescentes, por lo que se pueden utilizar para aplicaciones que utilizan tinciones fluorescentes, DIC o luz polarizada. [11]
Además de secciones de tejido, la LCM se puede realizar en células/organismos vivos, frotis de células, preparaciones de cromosomas y tejido vegetal.
El proceso de microdisección por captura láser no altera ni daña la morfología y la química de la muestra recolectada, ni las células circundantes. Por esta razón, la microdisección por captura láser es un método útil para recolectar células seleccionadas para análisis de ADN , ARN y/o proteínas . La microdisección por captura láser también se ha utilizado para aislar estructuras acelulares, como placas amiloides . [12] La microdisección por captura láser se puede realizar en una variedad de muestras de tejido , incluidos frotis de sangre , preparaciones citológicas, [13] cultivos celulares y alícuotas de tejido sólido. También se puede utilizar tejido de archivo congelado e incluido en parafina. [14]
