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Holotomografía

La holotomografía (HT) es una técnica láser para medir el índice de refracción tridimensional ( IR ) de una muestra microscópica, como células y tejidos biológicos . Debido a que el IR puede servir como un contraste de imagen intrínseco para objetos transparentes o en fase, las mediciones de los tomogramas de IR pueden proporcionar imágenes cuantitativas sin etiquetas de objetos de fase microscópica. Para medir el tomograma de IR 3-D de las muestras, la HT emplea el principio de imágenes holográficas y dispersión inversa. Por lo general, se miden múltiples imágenes holográficas 2D de una muestra en varios ángulos de iluminación, empleando el principio de imágenes interferométricas. Luego, se reconstruye un tomograma de IR 3D de la muestra a partir de estas múltiples imágenes holográficas 2D resolviendo inversamente la dispersión de luz en la muestra.

Historia

La primera propuesta teórica fue presentada por Emil Wolf [1] , y la primera demostración experimental fue mostrada por Fercher et al. [2] . Desde la década de 2000, las técnicas de HT han sido ampliamente estudiadas y aplicadas al campo de la biología y la medicina, por varios grupos de investigación, incluido el laboratorio de espectroscopia del MIT. Tanto los desarrollos técnicos como las aplicaciones de HT han avanzado significativamente. En 2012 se fundó la primera empresa comercial de HT, Nanolive [3] , seguida más tarde por Tomocube en 2014.

Principios

El principio de la tomografía computarizada con rayos X (TC) o la tomografía computarizada (TC). La tomografía computarizada mide múltiples imágenes de rayos X en 2D de un cuerpo humano en varios ángulos de iluminación y luego se recupera un tomograma en 3D (absortividad de rayos X) mediante la teoría de dispersión inversa. Tanto la TC con rayos X como la TC con láser comparten la misma ecuación rectora: la ecuación de Helmholtz , la ecuación de onda para una longitud de onda monocromática. La TC también se conoce como tomografía por difracción óptica. [4]

Ventajas y limitaciones

La HT ofrece las siguientes ventajas sobre las técnicas microscópicas 3D convencionales.

  1. Sin etiquetas: es posible obtener imágenes claras de la membrana celular y de los orgánulos subcelulares sin utilizar agentes de etiquetado exógenos. Por lo tanto, no hay problemas de fototoxicidad, fotodecoloración ni fotodaño.
  2. Capacidad de obtención de imágenes cuantitativas: la tecnología HT mide directamente los mapas RI tridimensionales de las células, que son propiedades ópticas intrínsecas de los materiales. Debido a que el RI medido se puede traducir a la densidad de masa de una célula y, utilizando esta información, también se puede recuperar la masa de una célula.
  3. Mediciones precisas y rápidas: HT proporciona una resolución espacial de hasta aproximadamente 100 nm y una resolución temporal de unos pocos a cientos de fotogramas por segundo, dependiendo de las aperturas numéricas de los objetivos utilizados y de la velocidad de un sensor de imagen.

Sin embargo, la tomografía 3D RI no proporciona especificidad molecular. En general, la información RI medida no se puede relacionar directamente con información sobre moléculas o proteínas, excepto en casos notables como las nanopartículas de oro [5] o las gotas de lípidos [6] que muestran valores RI claramente altos en comparación con el citoplasma celular.

Aplicaciones

Las aplicaciones de HT incluyen: [7]

Tomografía RI 3D de una célula viva (macrófago)

Biología celular

La HT proporciona imágenes dinámicas en 3D de células vivas y tejidos delgados sin utilizar agentes de marcado exógenos como proteínas fluorescentes o colorantes. La HT permite la obtención de imágenes cuantitativas de células vivas y también proporciona información cuantitativa como el volumen celular, el área de superficie y la concentración de proteínas. Se presentaron las imágenes sin marcadores y la cuantificación de cromosomas. [8] Se estudiaron las vías reguladoras de la degradación del proteasoma por autofagia en células utilizando HT. [9]

Imágenes correlativas

La HT se puede utilizar con otras modalidades de obtención de imágenes para la obtención de imágenes correlativas. Por ejemplo, una combinación de HT e imágenes de fluorescencia permite un enfoque analítico sinérgico. [10] [11] La HT proporciona información estructural, mientras que la señal de fluorescencia proporciona imágenes moleculares específicas, un análogo óptico de la tomografía por emisión de positrones (PET) y la TC. Se han informado varios enfoques para la obtención de imágenes correlativas utilizando HT.

Cuantificación de lípidos

Las gotitas de lípidos intracelulares desempeñan papeles importantes en el almacenamiento de energía y el metabolismo, y también están relacionadas con varias patologías, incluyendo el cáncer, la obesidad y la diabetes mellitus. La HT permite la obtención de imágenes y análisis cuantitativos y sin etiquetas para gotitas de lípidos libres o intracelulares. Debido a que las gotitas de lípidos tienen un IR claramente alto ( n > 1,375) en comparación con otras partes del citoplasma, las mediciones de los tomogramas de IR proporcionan información sobre el volumen, la concentración y la masa seca de las gotitas de lípidos. [12] Recientemente, la HT se utilizó para evaluar los efectos terapéuticos de un nanofármaco diseñado para afectar la administración dirigida de lobeglitazona midiendo las gotitas de lípidos en las células espumosas. [13]

Laboratorio experimental

La tomografía por emisión de positrones (HT) proporciona diversas capacidades de obtención de imágenes cuantitativas, proporcionando propiedades morfológicas, bioquímicas y mecánicas de células individuales. La tomografía por emisión de positrones (RI) 3D proporciona directamente propiedades morfológicas que incluyen volumen, área de superficie y esfericidad (redondez) de una célula. El valor de RI local se puede traducir en información bioquímica o concentración de proteína citoplasmática, porque el RI de una solución es linealmente proporcional a su concentración. [14] En particular, para el caso de los glóbulos rojos , el valor de RI se puede convertir en concentración de hemoglobina. Las mediciones de fluctuación dinámica de la membrana celular, que también se pueden obtener con un instrumento HT, proporcionan información sobre la deformabilidad celular. Además, estos diversos parámetros cuantitativos se pueden obtener a nivel de célula individual, lo que permite un análisis correlativo entre varios parámetros celulares. La HT se ha utilizado para el estudio de glóbulos rojos, [15] glóbulos blancos, [16] almacenamiento de sangre, [17] y diabetes. [18]

Enfermedades infecciosas

La capacidad de obtención de imágenes cuantitativas sin etiquetas de la HT se ha explotado para el estudio de varias enfermedades infecciosas. En particular, las células huésped invadidas por parásitos se pueden obtener imágenes y estudiar de manera efectiva utilizando HT. Esto se debe a que la tinción o el etiquetado de parásitos requiere un proceso de preparación complicado y la tinción/etiquetado no es muy eficaz en varios parásitos. La invasión de Plasmodium falciparum , o parásitos inductores de malaria, a glóbulos rojos individuales se midió utilizando HT. [19] La alteración estructural y biofísica de las células huésped y los parásitos se ha analizado sistemáticamente. También se estudió la invasión de parásitos babesia a los glóbulos rojos. [20] Toxoplasma gondii , un parásito apicomplejo que causa toxoplasmosis, puede infectar células nucleadas. Las alteraciones de la morfología 3D y las propiedades biofísicas de las células infectadas por T. gondii se estudiaron utilizando HT. [21]

Biotecnología

El volumen celular y la masa seca de bacterias individuales o microalgas se pueden cuantificar de manera efectiva utilizando HT. [22] Debido a que no requiere el proceso de tinción y al mismo tiempo proporciona valores de cuantificación precisos, HT se puede utilizar para probar la eficacia de tinciones diseñadas.

Comunidad científica

A continuación se muestran los congresos científicos activos sobre HT, como parte de las técnicas de imágenes de fase cuantitativa:

La técnica HT y sus aplicaciones se han incluido en los siguientes números especiales de revistas científicas:

Véase también

Referencias

  1. ^ Wolf, Emil (1969). "Determinación de la estructura tridimensional de objetos semitransparentes a partir de datos holográficos". Optics Communications . 1 (4): 153–156. Bibcode :1969OptCo...1..153W. doi :10.1016/0030-4018(69)90052-2.
  2. ^ Fercher, AF; Bartelt, H.; Becker, H.; Wiltschko, E. (1979). "Formación de imágenes por inversión de datos de campo dispersos: experimentos y simulación computacional". Óptica Aplicada . 18 (14): 2427–39. Bibcode :1979ApOpt..18.2427F. doi :10.1364/AO.18.002427. PMID  20212679.
  3. ^ "Inicio". nanolive.ch . Consultado el 26 de agosto de 2020 .
  4. ^ Lauer, V (2002). "Nuevo enfoque para la tomografía de difracción óptica que produce una ecuación vectorial de tomografía de difracción y un nuevo microscopio tomográfico". Journal of Microscopy . 205 (2): 165–176. doi :10.1046/j.0022-2720.2001.00980.x. PMID  11879431. S2CID  30791056.
  5. ^ Kim, Doyeon (2016). "Imágenes tridimensionales de alta resolución sin etiquetas de nanopartículas de oro dentro de células vivas mediante tomografía de difracción óptica". bioRxiv 10.1101/097113 . 
  6. ^ Kim, Kyoohyun (2016). "Imágenes tridimensionales sin etiquetas y cuantificación de gotas de lípidos en hepatocitos vivos". Scientific Reports . 6 : 36815. arXiv : 1611.01774 . Bibcode :2016NatSR...636815K. doi :10.1038/srep36815. PMC 5118789 . PMID  27874018. 
  7. ^ Park, YongKeun (2018). "Imágenes cuantitativas de fase en biomedicina". Nature Photonics . 12 (10): 578–589. Bibcode :2018NaPho..12..578P. doi :10.1038/s41566-018-0253-x. PMID  26648557. S2CID  126144855.
  8. ^ Kim, Seul (2020). "El H3R2me2a mediado por PRMT6 guía a Aurora B hacia los brazos cromosómicos para una segregación cromosómica adecuada". Nature Communications . 11 (1): 612. Bibcode :2020NatCo..11..612K. doi :10.1038/s41467-020-14511-w. PMC 6992762 . PMID  32001712. 
  9. ^ Choi, Won Hoon (11 de agosto de 2020). "Secuestro agresómico y ubiquitinación mediada por STUB1 durante la proteafagia de proteosomas inhibidos en mamíferos". PNAS . 117 (32): 19190–19200. Bibcode :2020PNAS..11719190C. doi : 10.1073/pnas.1920327117 . PMC 7430983 . PMID  32723828. 
  10. ^ Kim, YS; Lee, S.; Jung, J.; Shin, S.; Choi, HG; Cha, GH; Park, W.; Lee, S.; Park, Y. (2018). "Combinación de imágenes de fase cuantitativas tridimensionales y microscopía de fluorescencia para el estudio de la fisiopatología celular". Yale J Biol Med . 91 (3): 267–277. PMC 6153632 . PMID  30258314. 
  11. ^ Lambert, Aubrey (2020). "Imágenes de células vivas con holotomografía y fluorescencia". Microscopy Today . 28 : 18–23. doi : 10.1017/S1551929519001032 .
  12. ^ Kim, Kyoohyun; Lee, Seoeun; Yoon, Jonghee; Heo, Jihan; Choi, Chulhee; Park, Yongkeun (2016). "Imágenes tridimensionales sin etiquetas y cuantificación de gotas de lípidos en hepatocitos vivos". Scientific Reports . 6 : 36815. arXiv : 1611.01774 . Bibcode :2016NatSR...636815K. doi :10.1038/srep36815. PMC 5118789 . PMID  27874018. 
  13. ^ Park, Sangwoo; Ahn, Jae Won; Jo, Youngju; Kang, Ha-Young; Kim, Hyun Jung; Cheon, Yeongmi; Kim, Jin Won; Park, Yongkeun; Lee, Seongsoo; Park, Kyeongsoon (2020). "Imágenes tomográficas sin etiquetas de gotitas de lípidos en células espumosas para la evaluación terapéutica asistida por aprendizaje automático de nanofármacos específicos". ACS Nano . 14 (2): 1856–1865. doi :10.1021/acsnano.9b07993. PMID  31909985. S2CID  210087144.
  14. ^ Baber, R. (1952). "Microscopía de interferencia y determinación de masa". Nature . 169 (4296): 366–7. Código Bibliográfico :1952Natur.169..366B. doi :10.1038/169366b0. PMID  14919571. S2CID  4188525.
  15. ^ Park, YongKeun (2010). "Medición de la mecánica de los glóbulos rojos durante los cambios morfológicos". PNAS . 107 (15): 6731–6. Bibcode :2010PNAS..107.6731P. doi : 10.1073/pnas.0909533107 . PMC 2872375 . PMID  20351261. 
  16. ^ Yoon, Jonghee (2015). "Caracterización sin etiquetas de glóbulos blancos midiendo mapas de índice de refracción en 3D". Biomedical Optics Express . 6 (10): 3865–75. arXiv : 1505.02609 . Bibcode :2015arXiv150502609Y. doi :10.1364/BOE.6.003865. PMC 4605046 . PMID  26504637. 
  17. ^ Park, Hyunjoo (2016). "Medición del área de superficie celular y deformabilidad de glóbulos rojos humanos individuales durante el almacenamiento de sangre mediante imágenes de fase cuantitativas". Scientific Reports . 6 : 34257. Bibcode :2016NatSR...634257P. doi :10.1038/srep34257. PMC 5048416 . PMID  27698484. 
  18. ^ Lee, SangYun (2017). "Tomografías de índice de refracción y fluctuaciones dinámicas de la membrana de glóbulos rojos de pacientes con diabetes mellitus". Scientific Reports . 7 (1): 1039. Bibcode :2017NatSR...7.1039L. doi :10.1038/s41598-017-01036-4. PMC 5430658 . PMID  28432323. 
  19. ^ Park, YongKeun (2008). "Mapas de índice de refracción y dinámica de membrana de glóbulos rojos humanos parasitados por Plasmodium falciparum". PNAS . 105 (37): 13730–13735. Bibcode :2008PNAS..10513730P. doi : 10.1073/pnas.0806100105 . PMC 2529332 . PMID  18772382. 
  20. ^ HyunJoo, Park (2015). "Caracterización de glóbulos rojos de ratón individuales parasitados por Babesia microti usando microscopía holográfica 3-D". Scientific Reports . 5 : 10827. arXiv : 1505.00832 . Bibcode :2015NatSR...510827P. doi :10.1038/srep10827. PMC 4650620 . PMID  26039793. 
  21. ^ Firdaus, Egy Rahman; Park, Ji-Hoon; Lee, Seong-Kyun; Park, Yongkeun; Cha, Guang-Ho; Han, Eun-Taek (2020). "Cambios morfológicos y biofísicos en 3D en un solo taquizoíto y sus células infectadas mediante imágenes de fase cuantitativas tridimensionales". Journal of Biophotonics . 13 (8): e202000055. doi :10.1002/jbio.202000055. PMID  32441392. S2CID  218831871.
  22. ^ Ahn, Jung Ho; Seo, Hogyun; Park, Woojin; Seok, Jihye; Lee, Jong An; Kim, Won Jun; Kim, Gi Bae; Kim, Kyung-Jin; Lee, Sang Yup (2020). "Producción mejorada de ácido succínico por Mannheimia empleando malato deshidrogenasa óptima". Nature Communications . 11 (1): 1970. Bibcode :2020NatCo..11.1970A. doi :10.1038/s41467-020-15839-z. PMC 7181634 . PMID  32327663.