El peinado cromosómico (también conocido como peinado molecular o peinado de ADN) [1] es una técnica utilizada para producir una matriz de ADN uniformemente estirado que luego es muy adecuada para estudios de hibridación de ácidos nucleicos como la hibridación in situ fluorescente (FISH), que se benefician de la uniformidad del estiramiento, el fácil acceso a las secuencias objetivo de hibridación, [2] y la resolución que ofrece la gran distancia entre dos sondas, que se debe al estiramiento del ADN por un factor de 1,5 veces la longitud cristalográfica del ADN.
El ADN en solución (es decir, con una estructura enrollada aleatoriamente) se estira retrayendo el menisco de la solución a una velocidad constante (normalmente 300 μm/s). Los extremos de las cadenas de ADN, que se cree que están deshilachados (es decir, abiertos y con grupos polares expuestos) se unen a grupos ionizables que recubren una placa de vidrio silanizada a un pH inferior al pKa de los grupos ionizables (lo que garantiza que estén lo suficientemente cargados como para interactuar con los extremos del ADN). El resto del ADN, que es principalmente dsADN, no puede formar estas interacciones (aparte de unos pocos segmentos de "toque" a lo largo de la cadena de ADN), por lo que está disponible para la hibridación con sondas. A medida que el menisco se retrae, la retención superficial crea una fuerza que actúa sobre el ADN para retenerlo en la fase líquida; sin embargo, esta fuerza es inferior a la fuerza de unión del ADN; el resultado es que el ADN se estira al entrar en la fase de aire; Como la fuerza actúa en la localidad de la fase aire/líquido, es invariable a diferentes longitudes o conformaciones del ADN en solución, por lo que el ADN de cualquier longitud se estirará de la misma manera que se retrae el menisco. Como este estiramiento es constante a lo largo de la longitud de una cadena de ADN, la distancia a lo largo de la cadena se puede relacionar con el contenido de bases; 1 μm es aproximadamente equivalente a 2 kb.
Las regiones de ADN de interés se observan hibridándolas con sondas marcadas con haptenos como la biotina ; esto puede luego unirse con una o más capas de ligandos asociados a fluorocromos (como anticuerpos de inmunofluorescencia). También es posible el etiquetado multicolor. Esto tiene varios usos potenciales, típicamente como una técnica de mapeo físico de alta resolución (por ejemplo, para clonación posicional), un ejemplo de lo cual fue el mapeo correcto de 200 kb de la región del gen CAPN3, o el mapeo de secuencias no superpuestas (ya que la distancia entre dos sondas se puede medir con precisión). Por lo tanto, es útil para encontrar exones, microdeleciones, amplificaciones o reordenamientos. Antes de la mejora del peinado, la FISH era de resolución demasiado baja para ser útil en este caso. Con esta técnica, la resolución de la FISH está limitada teóricamente solo por la resolución del microscopio de epifluorescencia ; En la práctica, se obtienen resoluciones de alrededor de 2 μm para moléculas de ADN que suelen tener una longitud de 200 a 600 kb (aunque se ha utilizado la técnica de peinado FISH con cierto éxito en moléculas de más de 1 Mb de longitud), y puede haber margen de mejora mediante la optimización. Dado que los análisis de ADN que utilizan esta técnica son de una sola molécula, se pueden comparar genomas de diferentes células para encontrar anomalías, con implicaciones para el diagnóstico de cáncer y otras alteraciones genéticas.
El peinado cromosómico también se utiliza para estudiar la replicación del ADN , un proceso altamente regulado que depende de un programa específico de distribución temporal y espacial de la activación de los orígenes de replicación . Cada origen ocupa un locus genético distinto y debe activarse solo una vez por ciclo celular . El peinado cromosómico permite una visión de todo el genoma de la activación de los orígenes y la propagación de las horquillas de replicación . Como no se hacen suposiciones sobre la secuencia de los orígenes, esta técnica es particularmente útil para mapear los orígenes en eucariotas , que no se cree que tengan secuencias de iniciación definidas con precisión.
Las estrategias que implican peinar el ADN recientemente replicado generalmente implican la incorporación de nucleótidos modificados (como BrdU, bromodesoxiuridina ) en el ADN naciente, para luego detectarlo mediante fluorescencia. Como las horquillas de replicación se propagan bidireccionalmente desde los orígenes de replicación a velocidades (aproximadamente) iguales, [3] entonces se puede inferir la posición del origen. Reemplazar el grupo de nucleótidos modificados con un tipo diferente de nucleótido modificado después de una cierta cantidad de tiempo permite el desarrollo de una imagen resuelta en el tiempo de la activación de los sitios y la cinética de las horquillas de replicación. Se pueden identificar los sitios de pausa, resolver las horquillas de replicación fusionadas y estudiar la frecuencia de las activaciones del origen en diferentes períodos de tiempo.
En estudios in vitro realizados con extracto de huevo de Xenopus laevis, se ha demostrado que las frecuencias de disparo aumentan a medida que avanza la fase S. En otro estudio [4] sobre los episomas del virus de Epstein-Barr , se utilizaron sondas hibridadas para visualizar la distribución regional de los eventos de disparo; una zona particular mostró preferencia por el disparo, mientras que también se infirieron algunos sitios de pausa.
El peinado cromosómico lo realiza la empresa Genomic Vision, con sede en París.