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Captura de la conformación cromosómica

Tecnologías de captura de conformación cromosómica

Las técnicas de captura de conformación cromosómica (a menudo abreviadas como tecnologías 3C o métodos basados ​​en 3C [1] ) son un conjunto de métodos de biología molecular que se utilizan para analizar la organización espacial de la cromatina en una célula. Estos métodos cuantifican el número de interacciones entre loci genómicos que están cerca en el espacio 3-D, pero que pueden estar separados por muchos nucleótidos en el genoma lineal. [2] Dichas interacciones pueden resultar de funciones biológicas, como interacciones promotor - potenciador , o de bucles de polímeros aleatorios, donde el movimiento físico no dirigido de la cromatina hace que los loci colisionen. [3] Las frecuencias de interacción se pueden analizar directamente, [4] o se pueden convertir a distancias y utilizar para reconstruir estructuras 3-D. [5]

La principal diferencia entre los métodos basados ​​en 3C es su alcance. Por ejemplo, cuando se utiliza PCR para detectar la interacción en un experimento 3C, se cuantifican las interacciones entre dos fragmentos específicos. En cambio, Hi-C cuantifica las interacciones entre todos los pares posibles de fragmentos simultáneamente. La secuenciación profunda del material producido por 3C también produce mapas de interacciones de todo el genoma.

Historia

Históricamente, la microscopía fue el método principal para investigar la organización nuclear , [6] lo que se remonta a 1590. [7]

Métodos experimentales

Todos los métodos 3C comienzan con un conjunto similar de pasos, realizados en una muestra de células.

Comparación entre 3C y sus métodos derivados.

Primero, los genomas celulares se reticulan con formaldehído , [28] que introduce enlaces que "congelan" las interacciones entre los loci genómicos. El tratamiento de células con 1-3% de formaldehído, durante 10-30 minutos a temperatura ambiente es lo más común, sin embargo, es necesaria la estandarización para prevenir la reticulación alta de proteína-ADN, ya que esto puede afectar negativamente la eficiencia de la digestión de restricción en el paso posterior. [29] Luego, el genoma se corta en fragmentos con una endonucleasa de restricción . El tamaño de los fragmentos de restricción determina la resolución del mapeo de interacción. Las enzimas de restricción (RE) que realizan cortes en secuencias de reconocimiento de 6 pb, como EcoR1 o HindIII , se utilizan para este propósito, ya que cortan el genoma una vez cada 4000 pb, dando ~ 1 millón de fragmentos en el genoma humano. [29] [30] Para un mapeo de interacción más preciso, también se puede utilizar una RE de reconocimiento de 4 pb. El siguiente paso es la ligadura basada en proximidad . Esto ocurre en concentraciones bajas de ADN o dentro de núcleos intactos y permeabilizados [26] en presencia de la ADN ligasa T4 [31] , de modo que la ligación entre fragmentos interactuantes reticulados se ve favorecida por sobre la ligación entre fragmentos que no están reticulados. Posteriormente, los loci interactuantes se cuantifican amplificando las uniones ligadas mediante métodos de PCR. [29] [31]

Métodos originales

3C (uno contra uno)

El experimento de captura de conformación cromosómica (3C) cuantifica las interacciones entre un único par de loci genómicos. Por ejemplo, 3C se puede utilizar para probar una interacción promotor-potenciador candidata. Los fragmentos ligados se detectan utilizando PCR con cebadores conocidos . [2] [17] Es por ello que esta técnica requiere el conocimiento previo de las regiones interactuantes.

4C (uno contra todos)

La captura de conformación cromosómica en chip (4C) (también conocida como captura de conformación cromosómica circular) captura interacciones entre un locus y todos los demás loci genómicos. Implica un segundo paso de ligadura, para crear fragmentos de ADN autocircularizados, que se utilizan para realizar PCR inversa . La PCR inversa permite utilizar la secuencia conocida para amplificar la secuencia desconocida ligada a ella. [32] [2] [19] A diferencia de 3C y 5C, la técnica 4C no requiere el conocimiento previo de ambas regiones cromosómicas interactuantes. Los resultados obtenidos utilizando 4C son altamente reproducibles con la mayoría de las interacciones que se detectan entre regiones proximales entre sí. En un solo microarray, se pueden analizar aproximadamente un millón de interacciones. [ cita requerida ]

5C (muchos contra muchos)

La técnica de captura de la conformación cromosómica mediante copia de carbón (5C) detecta interacciones entre todos los fragmentos de restricción dentro de una región dada, siendo el tamaño de esta región típicamente no mayor que una megabase. [2] [20] Esto se hace ligando iniciadores universales a todos los fragmentos. Sin embargo, la técnica 5C tiene una cobertura relativamente baja. La técnica 5C supera los problemas de unión en el paso de ligadura intramolecular y es útil para construir interacciones complejas de loci específicos de interés. Este enfoque no es adecuado para realizar interacciones complejas a nivel de todo el genoma, ya que eso requerirá el uso de millones de iniciadores 5C. [ cita requerida ]

Hi-C (todos contra todos)

Hi-C utiliza una secuenciación de alto rendimiento para encontrar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos [2] [22] y utiliza la secuenciación de extremos emparejados , que recupera una secuencia corta de cada extremo de cada fragmento ligado. Como tal, para un fragmento ligado dado, las dos secuencias obtenidas deben representar dos fragmentos de restricción diferentes que se ligaron juntos en el paso de ligación basado en proximidad. El par de secuencias se alinea individualmente con el genoma, determinando así los fragmentos involucrados en ese evento de ligación. Por lo tanto, se prueban todas las posibles interacciones por pares entre fragmentos.

Métodos basados ​​en captura de secuencias

Varios métodos utilizan la captura de oligonucleótidos para enriquecer las bibliotecas 3C y Hi-C para loci específicos de interés. [33] [34] Estos métodos incluyen Capture-C, [35] NG Capture-C, [36] Capture-3C, [35] HiCap, [33] [37] Capture Hi-C. [38] y Micro Capture-C. [39] Estos métodos pueden producir una mayor resolución y sensibilidad que los métodos basados ​​en 4C, [40] Micro Capture-C proporciona la resolución más alta de las técnicas 3C disponibles y es posible generar datos de resolución de pares de bases. [39]

Métodos de una sola célula

Las adaptaciones de estos métodos a células individuales, como ChIP-seq y Hi-C, se pueden utilizar para investigar las interacciones que ocurren en células individuales. [41] [42]

Métodos de interacción múltiple

Varios métodos secuencian múltiples uniones de ligadura simultáneamente para detectar estructuras de orden superior en las que pueden estar interactuando múltiples regiones de cromatina. Estos métodos incluyen Tri-C, [43] 3way 4C/C-walks, [44] y multi-contact 4C (MC-4C). [45]

Métodos basados ​​en inmunoprecipitación

bucle ChIP

ChIP-loop combina 3C con ChIP-seq para detectar interacciones entre dos loci de interés mediadas por una proteína de interés. [2] [46] El ChIP-loop puede ser útil para identificar interacciones cis de largo alcance e interacciones trans mediadas a través de proteínas, ya que no se producirán colisiones frecuentes de ADN. [ cita requerida ]

Métodos de todo el genoma

ChIA-PET combina Hi-C con ChIP-seq para detectar todas las interacciones mediadas por una proteína de interés. [2] [23] HiChIP fue diseñado para permitir un análisis similar al de ChIA-PET con menos material de entrada. [47]

Impacto biológico

Los métodos 3C han llevado a una serie de conocimientos biológicos, incluido el descubrimiento de nuevas características estructurales de los cromosomas, la catalogación de bucles de cromatina y una mayor comprensión de los mecanismos de regulación transcripcional (cuya alteración puede provocar enfermedades). [6]

Los métodos 3C han demostrado la importancia de la proximidad espacial de los elementos reguladores a los genes que regulan. Por ejemplo, en los tejidos que expresan genes de globina , la región de control del locus de β-globina forma un bucle con estos genes. Este bucle no se encuentra en los tejidos donde no se expresa el gen. [48] Esta tecnología ha ayudado aún más al estudio genético y epigenético de los cromosomas tanto en organismos modelo como en humanos. [ no verificado en el cuerpo ]

Estos métodos han revelado una organización a gran escala del genoma en dominios de asociación topológica (TAD), que se correlacionan con marcadores epigenéticos. Algunos TAD son transcripcionalmente activos, mientras que otros están reprimidos. [49] Se han encontrado muchos TAD en D. melanogaster, ratones y humanos. [50] Además, el CTCF y la cohesina desempeñan papeles importantes en la determinación de los TAD y las interacciones potenciador-promotor. El resultado muestra que la orientación de los motivos de unión del CTCF en un bucle potenciador-promotor debe estar enfrentada entre sí para que el potenciador encuentre su objetivo correcto. [51]

Enfermedad humana

Existen varias enfermedades causadas por defectos en las interacciones promotor-potenciador, que se analizan en este artículo. [52]

La beta talasemia es un tipo determinado de trastorno sanguíneo causado por la eliminación del elemento potenciador de LCR. [53] [54]

La holoprosencefalia es un trastorno cefálico causado por una mutación en el elemento potenciador SBE2, que a su vez debilitó la producción del gen SHH. [55]

La PPD2 (polidactilia de un pulgar trifalángico) es causada por una mutación del potenciador ZRS, que a su vez fortalece la producción del gen SHH. [56] [57]

El adenocarcinoma de pulmón puede ser causado por una duplicación del elemento potenciador del gen MYC. [58]

La leucemia linfoblástica aguda de células T es causada por la introducción de un nuevo potenciador. [59]

Análisis de datos

Mapa de calor y visualización de gráfico circular de datos Hi-C. a. Interacciones Hi-C entre todos los cromosomas de células renales humanas G401, según lo representado por el software my5C. [60] b. Visualización de mapa de calor que ilustra la estructura bipartita del cromosoma X de ratón, según lo representado por Hi-Browse. [61] c. Visualización de mapa de calor de un locus de 3 Mbp (chr4:18000000-21000000), producido por Juicebox, utilizando datos Hi-C in situ de la línea celular GM12878. [4] d. Gráfico circular del cromosoma X bipartito de ratón, generado por Epigenome Browser. [62] Imagen de [63]

Los distintos experimentos de estilo 3C producen datos con estructuras y propiedades estadísticas muy diferentes, por lo que existen paquetes de análisis específicos para cada tipo de experimento. [34]

Los datos Hi-C se utilizan a menudo para analizar la organización de la cromatina en todo el genoma, como los dominios de asociación topológica (TAD), regiones linealmente contiguas del genoma que están asociadas en un espacio tridimensional. [49] Se han desarrollado varios algoritmos para identificar TAD a partir de datos Hi-C. [4] [64]

Hi-C y sus análisis posteriores están evolucionando. Fit-Hi-C [3] es un método basado en un enfoque de binning discreto con modificaciones de adición de distancia de interacción (ajuste de spline inicial, también conocido como spline-1) y refinamiento del modelo nulo (spline-2). El resultado de Fit-Hi-C es una lista de interacciones intracromosómicas por pares con sus valores p y valores q. [63]

La organización tridimensional del genoma también se puede analizar mediante la descomposición propia de la matriz de contacto. Cada vector propio corresponde a un conjunto de loci, que no son necesariamente linealmente contiguos, que comparten características estructurales. [65]

Un factor de confusión importante en las tecnologías 3C son las frecuentes interacciones no específicas entre loci genómicos que se producen debido al comportamiento aleatorio de los polímeros . Una interacción entre dos loci debe confirmarse como específica mediante pruebas de significación estadística. [3]

Normalización del mapa de contactos Hi-C

Existen dos formas principales de normalizar los mapas de calor de contacto Hi-C sin procesar. La primera forma es asumir una visibilidad igual, lo que significa que existe la misma probabilidad de que cada posición cromosómica tenga una interacción. Por lo tanto, la verdadera señal de un mapa de contacto Hi-C debe ser una matriz equilibrada (la matriz equilibrada tiene sumas de filas y columnas constantes). Un ejemplo de algoritmos que asumen una visibilidad igual es el algoritmo Sinkhorn-Knopp , que escala el mapa de contacto Hi-C sin procesar en una matriz equilibrada.

La otra forma es asumir que hay un sesgo asociado con cada posición cromosómica. El valor del mapa de contacto en cada coordenada será la señal verdadera en esa posición multiplicada por el sesgo asociado con las dos posiciones de contacto. Un ejemplo de algoritmos que apuntan a resolver este modelo de sesgo es la corrección iterativa, que elimina iterativamente el sesgo de fila y columna del mapa de contacto Hi-C sin procesar. Hay varias herramientas de software disponibles para el análisis de datos Hi-C. [66]

Análisis de motivos de ADN

Los motivos de ADN son secuencias de ADN cortas y específicas, a menudo de 8 a 20 nucleótidos de longitud [67], que están estadísticamente sobrerrepresentadas en un conjunto de secuencias con una función biológica común. En la actualidad, los motivos reguladores de las interacciones de largo alcance de la cromatina no se han estudiado en profundidad. Varios estudios se han centrado en dilucidar el impacto de los motivos de ADN en las interacciones promotor-potenciador.

Bailey et al. han identificado que el motivo ZNF143 en las regiones promotoras proporciona especificidad de secuencia para las interacciones promotor-potenciador. [68] La mutación del motivo ZNF143 disminuyó la frecuencia de las interacciones promotor-potenciador, lo que sugiere que ZNF143 es un nuevo factor de bucle de cromatina.

En 2016, Wong et al. informaron sobre un análisis de motivos a escala del genoma de una lista de 19 491 pares de motivos de ADN para la línea celular K562 en las interacciones promotor-potenciador. [69] Como resultado, propusieron que la multiplicidad de emparejamiento de motivos (número de motivos que se emparejan con un motivo determinado) está vinculada a la distancia de interacción y al tipo de región reguladora. El año siguiente, Wong publicó otro artículo en el que informaba de 18 879 pares de motivos en 6 líneas celulares humanas. [70] Una contribución novedosa de este trabajo es MotifHyades, una herramienta de descubrimiento de motivos que se puede aplicar directamente a secuencias emparejadas.

Análisis del genoma del cáncer

Las técnicas basadas en 3C pueden proporcionar información sobre los reordenamientos cromosómicos en los genomas del cáncer. [71] Además, pueden mostrar cambios en la proximidad espacial de los elementos reguladores y sus genes objetivo, lo que aporta una comprensión más profunda de la base estructural y funcional del genoma. [72]

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Lectura adicional

Véase también