Kaede es una proteína fluorescente fotoactivable que se origina naturalmente a partir de un coral pétreo , Trachyphyllia geoffroyi . Su nombre significa "arce" en japonés . Con la irradiación de luz ultravioleta (350–400 nm), Kaede sufre una fotoconversión irreversible de fluorescencia verde a fluorescencia roja.
Kaede es una proteína homotetramérica con un tamaño de 116 kDa . La estructura tetramérica se dedujo ya que su estructura primaria es de solo 28 kDa. Esta tetramerización posiblemente hace que Kaede tenga una baja tendencia a formar agregados cuando se fusiona con otras proteínas.
La propiedad de la proteína Kaede de fluorescencia fotoconvertida fue descubierta por casualidad y reportada por primera vez por Ando et al. en Proceedings of the United States National Academy of Sciences . [1] Se descubrió que una alícuota de proteína Kaede emitía fluorescencia roja después de dejarla en el banco y exponerla a la luz solar. Una verificación posterior reveló que Kaede, que originalmente es fluorescente verde, después de la exposición a la luz ultravioleta se fotoconvierte y se vuelve fluorescente roja. Entonces se le llamó Kaede.
La propiedad de fotoconversión en Kaede es aportada por el tripéptido , His 62 - Tyr 63 - Gly 64 , que actúa como un cromóforo verde que puede convertirse en rojo. [2] Una vez que se sintetiza Kaede, un cromóforo, 4-(p-hidroxibencilideno)-5-imidazolinona, derivado del tripéptido media la fluorescencia verde en Kaede. Cuando se expone a la luz UV, la proteína Kaede sufre una escisión no convencional entre el nitrógeno de la amida y el carbono α (Cα) en His62 a través de una reacción formal de β-eliminación. Seguida de la formación de un doble enlace entre His62-Cα y –Cβ, la π-conjugación se extiende al anillo de imidazol de His62. Se forma un nuevo cromóforo, 2-[(1E)-2-(5-imidazolil)etenil]-4-(p-hidroxibencilideno)-5-imidazolinona, con la propiedad de emitir luz roja.
La escisión del tripéptido se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. El Kaede verde no convertido muestra una banda a 28 kDa, mientras que se observan dos bandas a 18 kDa y 10 kDa para el Kaede rojo convertido, lo que indica que la escisión es crucial para la fotoconversión. [ cita requerida ]
El desplazamiento del espectro de absorción y emisión en Kaede se debe a la escisión del tripéptido. Antes de la fotoconversión, Kaede muestra un máximo de longitud de onda de absorción principal a 508 nm, acompañado de un ligero hombro a 475 nm. Cuando se excita a 480 nm, se emite fluorescencia verde con un pico de 518 nm. Cuando Kaede se irradia con luz ultravioleta o violeta, el pico de absorción principal se desplaza a 572 nm. Cuando se excita a 540 nm, Kaede mostró un máximo de emisión a 582 nm con un hombro a 627 nm y el pico de 518 nm. Después de esta fotoconversión se emite fluorescencia roja.
La fotoconversión en Kaede es irreversible. La exposición en la oscuridad o la iluminación a 570 nm no pueden restaurar su fluorescencia verde original. Se observa una fluorescencia reducida en Kaede rojo fotoconvertido cuando se expone intensamente a la luz de 405 nm, seguida de una recuperación parcial después de varios minutos.
Como todas las demás proteínas fluorescentes, Kaede puede ser un marcador óptico regional para la expresión genética y el etiquetado de proteínas para el estudio del comportamiento celular. [3]
Una de las aplicaciones más útiles es la visualización de neuronas . La delimitación de una neurona individual es difícil debido a los largos y delgados procesos que se entrelazan con otras neuronas. Incluso cuando las neuronas cultivadas se etiquetan con proteínas fluorescentes, siguen siendo difíciles de identificar individualmente debido al denso paquete.
En el pasado, esta visualización se podía realizar de forma convencional rellenando las neuronas con amarillo Lucifer o sulforodamina, lo que es una técnica laboriosa. [1] Después del descubrimiento de la proteína Kaede, se descubrió que era útil para delinear neuronas individuales. Las neuronas son transfectadas por el ADNc de la proteína Kaede y se irradian con rayos ultravioleta. La proteína Kaede roja fotoconvertida tiene libre difusión en la célula, excepto en el núcleo, y se extiende por toda la célula, incluidas las dendritas y el axón. Esta técnica ayuda a desenredar las redes complejas establecidas en un cultivo denso. Además, al etiquetar las neuronas con diferentes colores mediante irradiación con rayos ultravioleta con diferentes tiempos de duración, se pueden visualizar los sitios de contacto entre las neuronas rojas y verdes de interés. [1]
La capacidad de visualización de células individuales también es una herramienta poderosa para identificar la morfología precisa y los comportamientos migratorios de células individuales dentro de cortes corticales vivos . Mediante la proteína Kaede, se puede seguir un par particular de células hijas en células Kaede-positivas vecinas en la zona ventricular de cortes cerebrales de ratón . Se visualizan los límites entre células de las células hijas y se puede describir la posición y la distancia entre dos o más células. [4]
Como el cambio en el color fluorescente es inducido por la luz UV, el marcado de células y estructuras subcelulares es eficiente incluso cuando solo se induce una fotoconversión parcial.
Debido a la propiedad especial de la fluorescencia fotoconmutable, la proteína Kaede posee varias ventajas como marcador celular óptico .
Después de la fotoconversión, la proteína Kaede fotoconvertida emite una fluorescencia roja brillante y estable. Esta fluorescencia puede durar meses sin condiciones anaeróbicas. Como este estado rojo de Kaede es brillante y estable en comparación con el estado verde, y debido a que el Kaede verde sin convertir emite una intensidad muy baja de fluorescencia roja, las señales rojas proporcionan contraste. [1]
Además, antes de la fotoconversión, Kaede emite una fluorescencia verde brillante que permite visualizar la localización de la proteína no fotoactivada. Esto es superior a otras proteínas fluorescentes como PA-GFP y KFP1, que solo muestran una baja fluorescencia antes de la fotoactivación. [3]
Además, como tanto la fluorescencia verde como la roja de Kaede se excitan con luz azul a 480 nm para la observación, esta luz no inducirá la fotoconversión. Por lo tanto, las luces de iluminación para la observación y la fotoconversión se pueden separar por completo.
A pesar de la utilidad de Kaede para el seguimiento y la visualización de células, existen algunas limitaciones. Aunque Kaede cambia a rojo tras la exposición a luz ultravioleta o violeta y muestra un aumento de 2000 veces en la proporción de fluorescencia rojo-verde, el uso de las bandas de fluorescencia roja y verde puede causar problemas en experimentos con múltiples marcadores. La tetramerización de Kaede puede alterar la localización y el tráfico de proteínas de fusión, lo que limita la utilidad de Kaede como marcador de proteínas de fusión .
La propiedad de fotoconversión de Kaede no sólo contribuye a la aplicación en el etiquetado de proteínas y el seguimiento de células, sino que también es responsable de la gran variación en el color de los corales pétreos, Trachyphyllia geoffroyi . Bajo la luz del sol, debido a la fotoconversión de Kaede, los tentáculos y los discos se volverán rojos. Como el Kaede fluorescente verde se sintetiza continuamente, estos corales parecen verdes nuevamente a medida que se crea más Kaede sin convertir. Debido a la diferente proporción de Kaede fotoconvertido y sin convertir, se encuentra una gran diversidad de colores en los corales.
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