Un pico de ARN es una transcripción de ARN de secuencia y cantidad conocidas que se utiliza para calibrar mediciones en ensayos de hibridación de ARN , como experimentos de microarrays de ADN , RT-qPCR y RNA-Seq . [1]
Un spike-in está diseñado para unirse a una molécula de ADN con una secuencia coincidente , conocida como sonda de control . [2] [3] [4] Este proceso de unión específica se llama hibridación . Una cantidad conocida de spike-in de ARN se mezcla con la muestra experimental durante la preparación. [2] El grado de hibridación entre los spike-ins y las sondas de control se utiliza para normalizar las mediciones de hibridación del ARN de muestra. [2]
Los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos se han utilizado durante décadas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN, [5] con un precursor de microarray de ADN utilizado ya en 1965. [6] En tales ensayos, los oligonucleótidos de control positivo son necesarios para proporcionar un estándar para la comparación de la concentración de la secuencia objetivo, y para verificar y corregir la unión no específica ; es decir, la unión incidental del ARN a secuencias de ADN no complementarias . [7] Estos controles se conocieron como "spike-ins". [1] Con el advenimiento de los chips de microarray de ADN en la década de 1990 [8] y la comercialización de métodos de alto rendimiento para secuenciación y ensayos de detección de ARN, los fabricantes de "kits" de ensayo de hibridación comenzaron a proporcionar spike-ins desarrollados previamente. [1] En el caso de microarrays de ensayo de expresión génica o secuenciación de ARN (RNA-seq), se utilizan spike-ins de ARN.
Los ARN-ins se pueden sintetizar por cualquier medio de creación de ARN sintéticamente , o utilizando células para transcribir ADN a ARN in vivo (en células). [1] El ARN se puede producir in vitro (sin células) utilizando ARN polimerasa y ADN con la secuencia deseada. [1] Los fabricantes de biotecnología a gran escala producen ARN sintéticamente a través de técnicas de alto rendimiento y proporcionan soluciones de ARN-ins a una concentración predeterminada. [1] Las bacterias que contienen ADN (normalmente en plásmidos ) para la transcripción a ARN-ins también están disponibles comercialmente. [1] El ARN purificado se puede almacenar a largo plazo en una solución tamponada a baja temperatura. [1]
Los microarrays de ADN son superficies sólidas , generalmente un pequeño chip, a las que se unen covalentemente polímeros de ADN cortos de secuencia conocida . [6] Cuando una muestra de ARN desconocido fluye sobre el array, las bases de ARN se aparean con el ADN complementario y se unen a él . [6] Se pueden detectar transcripciones unidas, lo que indica la presencia de ARN con la secuencia correspondiente. [6] Los ensayos de microarrays de ADN son útiles en estudios de expresión genética , porque muchas de las transcripciones de ARNm presentes en una célula se pueden detectar al mismo tiempo. [6] Las incorporaciones de ARN de una cantidad conocida pueden proporcionar una señal de referencia para la comparación con la señal de las transcripciones de una cantidad desconocida, de modo que los datos se pueden normalizar dentro de un array y entre diferentes arrays. [2]
La secuenciación de ARN (RNA-Seq) se realiza mediante la transcripción inversa del ARN a ADN complementario (ADNc) y la secuenciación de alto rendimiento del ADNc. [9] Estos métodos de alto rendimiento pueden ser propensos a errores, y se necesitan controles conocidos para detectar y corregir los niveles de error. [9] Los controles de adición de ARN pueden proporcionar una medida de la sensibilidad y especificidad de un experimento de RNA-Seq. [9]