El microscopio electrónico de barrido ambiental ( ESEM ) es un microscopio electrónico de barrido (SEM) que permite la opción de recolectar micrografías electrónicas de muestras húmedas , sin recubrimiento o ambas al permitir un ambiente gaseoso en la cámara de la muestra. Aunque hubo éxitos anteriores al observar especímenes húmedos en cámaras internas en SEM modificados, el ESEM con sus detectores de electrones especializados (en lugar del detector estándar Everhart-Thornley ) y sus sistemas de bombeo diferencial, para permitir la transferencia del haz de electrones desde el El alto vacío en el área de la pistola y la alta presión alcanzable en su cámara de muestras lo convierten en un instrumento completo y único diseñado con el fin de obtener imágenes de muestras en su estado natural. El instrumento fue diseñado originalmente por Gerasimos Danilatos mientras trabajaba en la Universidad de Nueva Gales del Sur .
Comenzando con Manfred von Ardenne , [1] se informó de los primeros intentos de examinar muestras dentro de células "ambientales" con agua o gas atmosférico, junto con microscopios electrónicos de transmisión convencionales y de barrido . [2] [3] [4] [5] Sin embargo, las primeras imágenes de muestras húmedas en un SEM fueron reportadas por Lane en 1970 [6] cuando inyectó un fino chorro de vapor de agua sobre el punto de observación en la superficie de la muestra. ; el gas se difundió hacia el vacío de la cámara de muestras sin ninguna modificación en el instrumento. Además, Shah y Beckett informaron el uso de celdas o cámaras bombeadas diferencialmente para presumiblemente mantener los especímenes botánicos conductivos para permitir el uso del modo de corriente del espécimen absorbido para la detección de señales en 1977 [7] y en 1979. [8] Spivak et al. . informó sobre el diseño y uso de varias configuraciones de detección de células ambientales en un SEM, incluido el bombeo diferencial, o el uso de películas transparentes a los electrones para mantener las muestras en su estado húmedo en 1977. [9] Esas células, por su naturaleza, solo tenían una aplicación limitada. uso y no se realizó ningún desarrollo adicional. En 1974, Robinson [10] informó sobre un enfoque mejorado con el uso de un detector de electrones retrodispersados y bombeo de vacío diferencial con una sola apertura y la introducción de vapor de agua a una presión de alrededor de 600 Pa en el punto de congelación. Sin embargo, ninguno de esos enfoques produjo un instrumento lo suficientemente estable para el funcionamiento rutinario. Danilatos comenzó a trabajar con Robinson en 1978 en la Universidad de Nueva Gales del Sur en Sydney y emprendió un exhaustivo estudio cuantitativo y experimentación que dieron como resultado un funcionamiento estable del microscopio a temperatura ambiente y altas presiones de hasta 7000 Pa, como se informó en 1979 . 11] En los años siguientes, Danilatos, de forma independiente, informó sobre una serie de trabajos sobre el diseño y construcción de un microscopio electrónico de barrido ambiental o atmosférico (ASEM) capaz de trabajar a cualquier presión desde el vacío hasta una atmósfera. [12] [13] [14] [15] Estos primeros trabajos implicaron la optimización del sistema de bombeo diferencial junto con detectores de electrones retrodispersados (BSE) hasta 1983, cuando inventó el uso del propio gas ambiental como medio de detección. La década de 1980 se cerró con la publicación de dos importantes trabajos que abordan de forma integral los fundamentos de ESEM [16] y la teoría del dispositivo de detección de gases (GDD). [17]Además, en 1988, ElectroScan Corporation, [18] una empresa de capital riesgo que deseaba comercializar el Danilatos ESEM, exhibió el primer ESEM comercial en Nueva Orleans . La empresa puso énfasis en el modo de electrones secundarios (SE) del GDD [19] y aseguró el monopolio del ESEM comercial con una serie de patentes clave adicionales. [20] [21] [22] [23] Las empresas Philips y FEI [24] lograron que ElectroScan proporcionara instrumentos ESEM comerciales. Con la expiración de patentes clave y la asistencia de Danilatos, LEO [24] (sucedido por Carl Zeiss SMT ) añadió nuevos instrumentos comerciales al mercado . Hasta la fecha se han informado mejoras adicionales a partir del trabajo en el prototipo experimental original ESEM en Sydney y de muchos otros trabajadores que utilizan el ESEM comercial en una amplia variedad de aplicaciones en todo el mundo. Danilatos compiló una bibliografía completa en 1993 , mientras que se puede encontrar una encuesta más reciente en un Ph.D. Tesis de Morgan (2005). [26]
Un ESEM emplea un haz de electrones escaneados y lentes electromagnéticas para enfocar y dirigir el haz sobre la superficie de la muestra de manera idéntica a un SEM convencional. Se escanea un punto de electrón enfocado (sonda) muy pequeño en forma de trama sobre un área de muestra pequeña. Los electrones del haz interactúan con la capa superficial de la muestra y producen diversas señales (información) que se recogen con los detectores adecuados. La salida de estos detectores modula, mediante la electrónica adecuada, la pantalla de un monitor para formar una imagen que corresponde a la pequeña trama y a la información, píxel a píxel, que emana de la superficie de la muestra. Más allá de estos principios comunes, el ESEM se desvía sustancialmente de un SEM en varios aspectos, todos los cuales son importantes para el correcto diseño y funcionamiento del instrumento. El siguiente esquema destaca estos requisitos y cómo funciona el sistema.
La cámara de muestra que sostiene el ambiente gaseoso de alta presión está separada del alto vacío de la columna óptica electrónica con al menos dos pequeños orificios habitualmente denominados aberturas limitadoras de presión (PLA). El gas que se escapa a través de la primera abertura (PLA1) se elimina rápidamente del sistema con una bomba que mantiene una presión mucho más baja en la región aguas abajo (es decir, inmediatamente encima de la abertura). [14] Esto se llama bombeo diferencial. Parte del gas escapa más lejos de la región de baja presión (etapa 1) a través de una segunda abertura limitadora de presión (PLA2) hacia la región de vacío de la columna superior, lo que constituye un bombeo diferencial de segunda etapa (etapa 2). Un diagrama esquemático muestra las etapas básicas de presión del gas ESEM, incluida la cámara de muestras, la cavidad intermedia y la columna óptica electrónica superior. [27] Las presiones correspondientes alcanzadas son p 0 >> p 1 >> p 2 , que es una condición suficiente para un microscopio que emplea un cañón de electrones del tipo de tungsteno. Se pueden agregar etapas de bombeo adicionales para lograr un vacío aún mayor, como se requiere para un LaB 6 y cañones de electrones del tipo de emisión de campo. El diseño y la forma de una abertura limitadora de presión son críticos para obtener el gradiente (transición) de presión más pronunciado posible a través de ella. Esto se logra con un orificio hecho en una placa delgada y ahusado en la dirección aguas abajo, como se muestra en los contornos de isodensidad adjuntos de un gas que fluye a través del PLA1. Esto se hizo con una simulación por computadora de las colisiones de moléculas de gas y su movimiento a través del espacio en tiempo real. [28] [29] Podemos ver inmediatamente en la figura de los contornos de isodensidad del gas a través de la apertura que la densidad del gas disminuye en aproximadamente dos órdenes de magnitud a lo largo de unos pocos radios de apertura. Esta es una demostración cuantitativamente vívida de un primer principio que permite la separación de la cámara de muestras de alta presión de las regiones de baja presión y vacío superiores.
De esta manera, los campos de flujo de gas se han estudiado en una variedad de situaciones de instrumentos, [30] en las que posteriormente se ha cuantificado la transferencia del haz de electrones.
Mediante el uso de bombeo diferencial, se genera un haz de electrones que se propaga libremente en el vacío de la columna superior, desde el cañón de electrones hasta PLA2, desde cuyo punto en adelante el haz de electrones pierde gradualmente electrones debido a la dispersión de electrones por las moléculas de gas. Inicialmente, la cantidad de dispersión de electrones es insignificante dentro de la cavidad intermedia, pero a medida que el haz encuentra un chorro de gas cada vez más denso formado por el PLA1, las pérdidas se vuelven significativas. [29] Después de que el haz ingresa a la cámara de muestra, las pérdidas de electrones aumentan exponencialmente a un ritmo que depende de la presión predominante, la naturaleza del gas y el voltaje de aceleración del haz. La fracción de haz transmitido a lo largo del eje PLA1 se puede ver mediante un conjunto de curvas características para un producto dado p 0 D, [29] donde D es el diámetro de apertura. Con el tiempo, el haz de electrones se dispersa por completo y se pierde, pero antes de que esto suceda, se retiene una cantidad útil de electrones en el punto enfocado original a una distancia finita, que aún se puede utilizar para obtener imágenes. Esto es posible porque los electrones eliminados se dispersan y distribuyen en un área amplia como un faldón ( faldón de electrones ) que rodea el punto enfocado. [31] Debido a que el ancho de la falda de electrones es órdenes de magnitud mayor que el ancho del punto, con órdenes de magnitud menos densidad de corriente, la falda contribuye solo con ruido de fondo (señal) sin participar en el contraste generado por el punto central. Las condiciones particulares de presión, distancia y voltaje del haz sobre las cuales el haz de electrones sigue siendo útil para fines de obtención de imágenes se han denominado régimen de oligodispersión [32], a diferencia de los regímenes de dispersión simple, plural y múltiple utilizados en la literatura anterior.
Para un voltaje y gas de aceleración del haz dados, la distancia L desde PLA1, sobre la cual es posible obtener imágenes útiles, es inversamente proporcional a la presión de la cámara p 0 . Como regla general, para un haz de 5 kV en el aire, se requiere que el producto p 0 L = 1 Pa·m o menos. Según este segundo principio de transferencia de haz de electrones, el diseño y funcionamiento de un ESEM se centra en refinar y miniaturizar todos los dispositivos que controlan el movimiento y manipulación de la muestra, y la detección de señales. Luego, el problema se reduce a lograr suficiente precisión de ingeniería para que el instrumento funcione cerca de su límite físico, correspondiente al rendimiento óptimo y al rango de capacidades. [29] [33] Se ha introducido una figura de mérito para tener en cuenta cualquier desviación de una máquina determinada de la capacidad de rendimiento óptima. [33]
El haz de electrones incide sobre la muestra y, dependiendo de la tensión de aceleración y de la naturaleza de la muestra, penetra hasta una determinada profundidad. A partir de la interacción resultante se generan señales del mismo modo que en un SEM. Así, obtenemos electrones secundarios y retrodispersados, rayos X y catodoluminiscencia (luz). Todas estas señales también se detectan en el ESEM pero con ciertas diferencias en el diseño del detector y los principios utilizados.
El detector de electrones secundario convencional de SEM ( detector Everhart-Thornley ) no se puede utilizar en presencia de gas debido a una descarga eléctrica (arco) causada por la polarización de kilovoltios asociada con este detector. En lugar de esto, el propio gas ambiental se ha utilizado como detector para obtener imágenes en este modo:
De forma sencilla, el dispositivo de detección de gases (GDD) emplea un electrodo con un voltaje de hasta varios cientos de voltios para recoger los electrones secundarios en el ESEM. El principio de este detector SE se describe mejor considerando dos placas paralelas separadas por una distancia d con una diferencia de potencial V que genera un campo eléctrico uniforme E = V/d , y se muestra en el diagrama adjunto del GDD. [17] [27] Los electrones secundarios liberados de la muestra en el punto de impacto del haz son impulsados por la fuerza del campo hacia el electrodo del ánodo, pero los electrones también se mueven radialmente debido a la difusión térmica de las colisiones con las moléculas de gas. La variación de la fracción de recolección de electrones R dentro del radio del ánodo r frente a r/d , para valores fijos de polarización del ánodo V , con un producto constante de (presión·distancia) p·d = 1 Pa·m, viene dada por las curvas características adjuntas. de eficiencia del GDD. Todos los electrones secundarios se detectan si los parámetros de este dispositivo están diseñados correctamente. Esto muestra claramente que es posible prácticamente un 100% de eficiencia dentro de un pequeño radio del electrodo colector con sólo una polarización moderada. En estos niveles de sesgo, no se produce ninguna descarga catastrófica. En cambio, se genera una multiplicación proporcional controlada de electrones cuando los electrones chocan con las moléculas de gas liberando nuevos electrones en su camino hacia el ánodo. Este principio de amplificación de avalanchas funciona de manera similar a los contadores proporcionales utilizados para detectar radiación de alta energía. La señal así captada por el ánodo se amplifica y procesa aún más para modular una pantalla de visualización y formar una imagen como en SEM. En particular, en este diseño y la amplificación de electrones gaseosos asociada, el producto p·d es un parámetro independiente, de modo que existe una amplia gama de valores de presión y geometría del electrodo que pueden describirse mediante las mismas características. La consecuencia de este análisis es que los electrones secundarios son posibles de detectar en un ambiente gaseoso incluso a altas presiones, dependiendo de la eficacia de ingeniería de cualquier instrumento determinado.
Como característica adicional del GDD, una avalancha de centelleo gaseoso también acompaña a la avalancha de electrones y, mediante la detección de la luz producida con un fotomultiplicador, se pueden tomar de forma rutinaria las imágenes SE correspondientes. La respuesta de frecuencia de este modo ha permitido el uso de velocidades de escaneo de TV reales. [34] Este modo del detector ha sido empleado por una última generación de instrumentos comerciales.
El novedoso GDD fue posible por primera vez en el ESEM y ha producido una eficiencia de recolección de SE de prácticamente el 100% que antes no era posible con el detector SE de Everhart-Thornley, donde no todas las trayectorias libres de los electrones en el vacío pueden desviarse hacia el detector. [17] Como se explica con más detalle a continuación, los electrones retrodispersados también pueden detectarse mediante las interacciones señal-gas, por lo que se deben controlar varios parámetros de este detector gaseoso generalizado para separar el componente BSE de la imagen SE. Por lo tanto, se ha tenido cuidado de producir imágenes SE casi puras con estos detectores, entonces llamados ESD (detector secundario ambiental) [35] y GSED (detector de electrones secundario gaseoso). [36]
Los electrones retrodispersados (BSE) son aquellos emitidos desde la muestra debido a interacciones haz-muestra donde los electrones sufren dispersión elástica e inelástica . Tienen energías desde 50 eV hasta la energía del haz primario por definición convencional. Para la detección y obtención de imágenes con estos electrones, en el SEM se han utilizado materiales centelleantes y de estado sólido. Estos materiales se han adaptado y utilizado también en ESEM además del uso del GDD para la detección e imágenes de EEB.
BSE pasa a través del volumen gaseoso entre los electrodos del GDD y genera ionización adicional y amplificación de avalancha. Hay un volumen interior donde dominan los electrones secundarios con una contribución de BSE pequeña o insignificante, mientras que el volumen gaseoso exterior actúa principalmente sobre el BSE. Es posible separar los volúmenes de detección correspondientes para poder obtener imágenes de EEB casi puras con el GDD. La relación de intensidad relativa de las dos señales, SE y BSE, se ha resuelto mediante ecuaciones detalladas de distribución de carga en el ESEM. [37] El análisis de electrodos planos es esencial para comprender los principios y requisitos involucrados y de ninguna manera indica la mejor elección de configuración de electrodos, como se analiza en la teoría publicada del GDD.
A pesar de los avances anteriores, los detectores de EEB dedicados en el ESEM han desempeñado un papel importante, ya que el EEB sigue siendo un modo de detección muy útil que produce información que no es posible obtener con SE. Los medios de detección de EEB convencionales han sido adaptados para operar en las condiciones gaseosas del ESEM. Los BSE que tienen una alta energía son autopropulsados hacia el detector correspondiente sin una obstrucción significativa por parte de las moléculas de gas. Ya se han empleado detectores de estado sólido anulares o cuadrantes para este propósito, pero su geometría no se adapta fácilmente a los requisitos de ESEM para un funcionamiento óptimo. Como resultado, no se ha informado mucho sobre el uso de estos detectores en instrumentos ESEM genuinos a alta presión. El detector BSE "Robinson" [38] está ajustado para funcionar hasta alrededor de 100 Pa a la distancia de trabajo habitual del SEM convencional para la supresión de la carga de la muestra, mientras que la recolección de electrones a una distancia de trabajo corta y en condiciones de alta presión lo hacen inadecuado para el ESEM. Sin embargo, para la EEB se han utilizado materiales plásticos centelleantes que son fácilmente adaptables y se han fabricado a medida según los requisitos más estrictos del sistema. Dicho trabajo culminó con el uso de un par de detectores en forma de cuña que sujetan un PLA1 cónico y se apoyan en su borde, de modo que el espacio de detección de muertos se reduce al mínimo, como se muestra en la figura adjunta de detectores de EEB óptimos . [14] La conducción de fotones también se optimiza mediante la geometría de los tubos de luz, mientras que el par de detectores simétricos permiten que la separación de la topografía (resta de señales) y el contraste del número atómico (suma de señales) de la superficie de la muestra se muestren con la mejor calidad. siempre relación señal-ruido. Este esquema ha permitido además el uso del color al superponer varias señales de manera significativa. [39] Estos detectores simples pero especiales fueron posibles en las condiciones de ESEM, ya que el plástico desnudo no se carga con la BSE. Sin embargo, se ha propuesto una malla de alambre muy fina con el espaciado adecuado [40] como GDD cuando hay gas presente y para conducir la carga negativa desde los detectores de plástico cuando se bombea el gas hacia un ESEM universal. Además, dado que la electrónica asociada implica un fotomultiplicador con una amplia respuesta de frecuencia, las verdaderas velocidades de escaneo de TV están fácilmente disponibles. Este es un atributo esencial a mantener con un ESEM que permite el examen de procesos in situ en tiempo real. En comparación, todavía no se han registrado imágenes de este tipo con el modo de avalancha de electrones del GDD.
El uso de detectores de centelleo de BSE en ESEM es compatible con el GDD para la detección simultánea de SE, de una manera reemplazando el electrodo del plano superior con un electrodo de aguja de punta fina (detector), que se puede acomodar fácilmente con estos detectores de centelleo de BSE. También se han estudiado exhaustivamente el detector de aguja y la geometría cilíndrica (alambre). [17]
La catodoluminiscencia es otro modo de detección que involucra los fotones generados por la interacción haz-espécimen. Se ha demostrado que este modo funciona también en ESEM mediante el uso de tubos de luz después de que se les haya quitado el revestimiento centelleante utilizado anteriormente para la detección de EEB. Sin embargo, no se sabe mucho sobre su uso fuera del prototipo experimental probado originalmente. [41] Claramente, ESEM es más poderoso y significativo bajo este modo de detección que SEM, ya que la superficie natural de cualquier muestra puede examinarse en el proceso de obtención de imágenes. La catodoluminiscencia es una propiedad de los materiales, pero con los diversos tratamientos de las muestras requeridos y otras limitaciones en SEM, las propiedades se oscurecen o se alteran o son imposibles de detectar y, por lo tanto, este modo de detección no se ha vuelto popular en el pasado. La llegada de ESEM con su potencial ilimitado puede provocar también un mayor interés en esta área en el futuro.
Los rayos X elementales característicos producidos también en el ESEM pueden detectarse mediante los mismos detectores utilizados en el SEM. Sin embargo, existe una complejidad adicional que surge de los rayos X producidos por la falda de electrones. Estos rayos X provienen de un área más grande que en SEM y la resolución espacial se reduce significativamente, ya que las señales de rayos X "de fondo" no pueden simplemente "suprimirse" del volumen de interacción de la sonda. Sin embargo, se han propuesto varios esquemas para resolver este problema. [42] [43] [44] [45] Estos métodos implican el enmascaramiento de puntos o la técnica de extrapolación variando la presión y calibrando los efectos del faldón, mediante lo cual se ha logrado una mejora considerable.
En SEM al vacío, el modo de corriente absorbida de la muestra se utiliza como modo alternativo para obtener imágenes de muestras conductoras. La corriente de la muestra resulta de la diferencia de la corriente del haz de electrones menos la suma de las corrientes SE y BSE. Sin embargo, en presencia de gas y la ionización resultante, sería problemático separar este modo de detección del dispositivo de detección gaseoso que funciona generalmente . De ahí que este modo, por su definición, pueda considerarse insostenible en el ESEM. Shah y Becket [8] asumieron el funcionamiento del espécimen en modo de corriente absorbida si la conductividad de su espécimen estaba asegurada durante el examen de muestras botánicas húmedas; de hecho, Shah en 1987 [46] todavía consideraba los productos de ionización en el gas por SE y BSE como un obstáculo formidable, ya que creía que la ionización no contenía ninguna información sobre la muestra. Sin embargo, más tarde optó por corregir el papel de la ionización gaseosa durante la formación de imágenes. [47]
El haz de electrones que incide sobre las muestras aislantes acumula carga negativa, lo que crea un potencial eléctrico que tiende a desviar el haz de electrones del punto escaneado en el SEM convencional. Esto aparece como artefactos de carga en la imagen, que se eliminan en el SEM depositando una capa conductora en la superficie de la muestra antes del examen. En lugar de este recubrimiento, el gas en el ESEM es conductor de electricidad y evita la acumulación de carga negativa. La buena conductividad del gas se debe a la ionización que sufre por el haz de electrones incidente y las señales ionizantes SE y BSE. [48] [49] Este principio constituye otra desviación fundamental de la microscopía electrónica de vacío convencional, con enormes ventajas.
Como consecuencia de la forma en que funciona ESEM, la resolución se conserva en relación con el SEM. Esto se debe a que el poder de resolución del instrumento está determinado por el diámetro del haz de electrones, que no se ve afectado por el gas a lo largo de la distancia útil recorrida antes de que se pierda por completo. [31] Esto se ha demostrado en los ESEM comerciales que proporcionan los puntos de haz más finos al obtener imágenes de muestras de prueba, es decir, habitualmente partículas de oro sobre un sustrato de carbono , tanto en vacío como en gas. Sin embargo, el contraste disminuye en consecuencia a medida que la sonda electrónica pierde corriente con la distancia recorrida y el aumento de presión. La pérdida de intensidad de corriente, si es necesario, puede compensarse aumentando la corriente del haz incidente, lo que va acompañado de un mayor tamaño del punto. Por lo tanto, la resolución práctica depende del contraste de la muestra original de una característica determinada, del diseño del instrumento que debe proporcionar pérdidas mínimas de haz y señal y de que el operador seleccione los parámetros correctos para cada aplicación. Los aspectos de contraste y resolución han sido determinados de manera concluyente en el trabajo referenciado sobre los fundamentos de ESEM. Además, en relación con esto, debemos considerar los efectos de la radiación sobre la muestra.
La mayoría de los instrumentos disponibles ventilan su cámara de muestras a la presión ambiental (100 kPa) con cada transferencia de muestras. Es necesario bombear un gran volumen de gas y reemplazarlo con el gas de interés, generalmente vapor de agua suministrado desde un depósito de agua conectado a la cámara a través de alguna válvula reguladora de presión (por ejemplo, de aguja). En muchas aplicaciones esto no presenta ningún problema, pero en aquellas que requieren una humedad relativa ininterrumpida del 100%, se ha descubierto que la eliminación del gas ambiental va acompañada de una reducción de la humedad relativa por debajo del nivel del 100% durante la transferencia de la muestra. [50] Esto claramente contradice el propósito mismo de ESEM para esta clase de aplicaciones. Sin embargo, tal problema no surge con el prototipo original ESEM que utiliza una cámara de transferencia de muestras intermedia, de modo que la cámara principal siempre se mantiene al 100% de humedad relativa sin interrupción durante un estudio. [51] La cámara de transferencia de muestras (tr-ch) que se muestra en el diagrama de las etapas de presión de gas ESEM contiene un pequeño depósito de agua para que el aire ambiental inicial pueda bombearse rápidamente y reemplazarse prácticamente instantáneamente con vapor de agua sin pasar por una conductancia limitada. tubo y válvula. La cámara principal de muestras se puede mantener al 100% de humedad relativa, si la única fuga de vapor es a través del pequeño PLA1, pero no durante el bombeo violento con cada cambio de muestra. Una vez que la muestra húmeda está en equilibrio con una humedad relativa del 100 % en la cámara de transferencia, en cuestión de segundos, se abre una válvula de compuerta y la muestra se transfiere a la cámara principal de muestras mantenida a la misma presión. Un enfoque alternativo que implica el bombeo controlado de la cámara principal [50] puede no resolver el problema por completo, ya sea porque no se puede alcanzar la humedad relativa del 100% de manera monótona sin ningún secado, o porque el proceso es muy lento; La inclusión de un depósito de agua dentro de la cámara principal significa que no se puede reducir la humedad relativa hasta que se haya bombeado toda el agua (es decir, un control defectuoso de la humedad relativa).
Durante la interacción de un haz de electrones con una muestra, los cambios en la muestra en diversos grados son casi inevitables. Estos cambios, o efectos de la radiación, pueden volverse visibles o no tanto en SEM como en ESEM. Sin embargo, tales efectos son particularmente importantes en el ESEM que afirma tener la capacidad de ver especímenes en su estado natural. La eliminación del vacío es un gran éxito en este sentido, por lo que cualquier efecto perjudicial del propio haz de electrones requiere una atención especial. La mejor manera de solucionar este problema es reducir estos efectos al mínimo absoluto con un diseño ESEM óptimo. Más allá de esto, el usuario debe ser consciente de su posible existencia durante la evaluación de resultados. Por lo general, estos efectos aparecen en las imágenes de diversas formas debido a diferentes interacciones y procesos entre el haz de electrones y la muestra. [52]
La introducción de gas en un microscopio electrónico equivale a una nueva dimensión. Por lo tanto, las interacciones entre el haz de electrones y el gas, junto con las interacciones del gas (y sus subproductos) con la muestra, marcan el comienzo de una nueva área de investigación con consecuencias aún desconocidas. Algunas de ellas pueden parecer al principio desventajosas, pero luego se superan; otras pueden dar resultados inesperados. La fase líquida en la muestra con radicales móviles puede producir una multitud de fenómenos ventajosos o desventajosos.
La presencia de gas alrededor de una muestra crea nuevas posibilidades exclusivas de ESEM: (a) la microscopía electrónica en fase líquida [53] es posible ya que cualquier presión superior a 609 Pa permite mantener el agua en su fase líquida para temperaturas superiores a 0 °C, a diferencia del SEM, donde las muestras se secan mediante condiciones de vacío. (b) Las muestras eléctricamente no conductoras no requieren las técnicas de preparación utilizadas en SEM para hacer que la superficie sea conductora, como la deposición de una fina capa de oro o carbono, u otros tratamientos, técnicas que también requieren vacío en el proceso. Las muestras aislantes se cargan con el haz de electrones, lo que hace que la obtención de imágenes sea problemática o incluso imposible. (c) El gas en sí se utiliza como medio de detección produciendo nuevas posibilidades de obtención de imágenes, a diferencia de los detectores SEM de vacío. (d) Los detectores centelleantes de EEB de plástico simple pueden funcionar sin recubrimiento y sin carga. Por lo tanto, estos detectores producen la relación señal-ruido más alta posible con el voltaje de aceleración más bajo posible, porque los BSE no disipan energía en un recubrimiento de aluminio utilizado para el SEM de vacío.
Como resultado, las muestras se pueden examinar más rápida y fácilmente, evitando métodos de preparación complejos y que requieren mucho tiempo, sin modificar la superficie natural ni crear artefactos por el trabajo de preparación anterior o el vacío del SEM. Las interacciones gas/líquido/sólido se pueden estudiar dinámicamente in situ y en tiempo real, o registrarse para su posprocesamiento. Las variaciones de temperatura desde bajo cero hasta más de 1000 °C y varios dispositivos auxiliares para la micromanipulación de muestras se han convertido en una nueva realidad. Los especímenes biológicos se pueden mantener frescos y vivos. Por lo tanto, ESEM constituye un avance radical con respecto a la microscopía electrónica convencional, donde la condición de vacío impedía que las ventajas de las imágenes por haz de electrones se volvieran universales.
La principal desventaja surge de la limitación de la distancia en la cámara de muestras a través de la cual el haz de electrones sigue siendo utilizable en un entorno gaseoso. La distancia útil de la muestra al PLA1 es función del voltaje de aceleración, la corriente del haz, la naturaleza y presión del gas y el diámetro de apertura utilizado. [29] [33] Esta distancia varía desde alrededor de 10 mm hasta una fracción de milímetro, ya que la presión del gas puede variar desde un bajo vacío hasta una atmósfera. Para un funcionamiento óptimo, tanto el fabricante como el usuario deben ajustarse, en el diseño y funcionamiento, a satisfacer este requisito fundamental. Además, como la presión puede reducirse a un nivel muy bajo, un ESEM volverá al funcionamiento típico de SEM sin las desventajas anteriores. Por lo tanto, se pueden compensar las características de ESEM con las de SEM operando en el vacío. Se puede lograr una conciliación de todas estas desventajas y ventajas mediante un ESEM universal diseñado y operado adecuadamente.
Junto con la limitación de la distancia útil de la muestra está el aumento mínimo posible, ya que a una presión muy alta la distancia se vuelve tan pequeña que el campo de visión está limitado por el tamaño del PLA1. En el rango de aumento muy bajo del SEM, superpuesto al aumento superior de un microscopio óptico, el campo superior está limitado en diversos grados por el modo ESEM. El grado de esta limitación depende en gran medida del diseño del instrumento.
Como los rayos X también son generados por el gas circundante y también provienen de un área de muestra más grande que en SEM, se requieren algoritmos especiales para deducir los efectos del gas en la información extraída durante el análisis.
La presencia de gas puede producir efectos no deseados en determinadas aplicaciones, pero su alcance sólo quedará claro a medida que se realicen más investigaciones y desarrollo para minimizar y controlar los efectos de la radiación.
No hay ningún instrumento comercial disponible todavía (en 2009) que cumpla con todos los principios de un diseño óptimo, por lo que cualquier otra limitación enumerada es característica de los instrumentos existentes y no de la técnica ESEM en general.
El ESEM también se puede utilizar en modo de transmisión (TESEM) mediante medios de detección adecuados de las señales de campo claro y oscuro transmitidas a través de una sección delgada de la muestra. Esto se hace empleando detectores de estado sólido debajo de la muestra, [54] o el uso del dispositivo de detección de gases (GDD). [55] Los voltajes de aceleración generalmente bajos utilizados en ESEM mejoran el contraste de las muestras no teñidas al tiempo que permiten obtener imágenes con resolución nanométrica obtenidas en el modo de transmisión, especialmente con cañones de electrones del tipo de emisión de campo.
ESEM-DIA es una abreviatura de un sistema que consta de un microscopio ESEM acoplado a un programa de análisis de imágenes digitales (DIA). Hace posible directamente el tratamiento cuantitativo de las imágenes ESEM adquiridas digitalmente y permite el reconocimiento y el procesamiento de imágenes mediante aprendizaje automático basado en redes neuronales. [56] [57] [58]
Algunas aplicaciones representativas de ESEM se encuentran en las siguientes áreas:
Una de las primeras aplicaciones implicó el examen de material vegetal fresco y vivo, incluido un estudio de Leptospermum flavescens . [59] Se han demostrado las ventajas de ESEM en estudios de microorganismos [35] y una comparación de técnicas de preparación. [60]
La influencia de los fármacos sobre las células cancerosas se ha estudiado con ESEM-STEM en fase líquida. [61]
En las ciencias de la conservación, a menudo es necesario preservar los especímenes intactos o en su estado natural. [62]
Se han realizado estudios ESEM sobre fibras de la industria lanera con y sin tratamientos químicos y mecánicos particulares. [63] En la industria del cemento, es importante examinar diversos procesos in situ en estado húmedo y seco. [64] [65]
Los estudios in situ se pueden realizar con la ayuda de varios dispositivos auxiliares. Estos han involucrado etapas calientes para observar procesos a temperaturas elevadas, [66] microinyectores de líquidos [67] y dispositivos de extensión o deformación de muestras. [68]
Las biopelículas se pueden estudiar sin los artefactos introducidos durante la preparación del SEM, [69] [70] , así como la dentina [71] y los detergentes [72] se han investigado desde los primeros años de ESEM.
El ESEM ha aparecido bajo diferentes marcas de fabricación. El término ESEM es un nombre genérico introducido públicamente por primera vez en 1980 [73] [74] y luego utilizado incesantemente en todas las publicaciones de Danilatos y casi todos los usuarios de todos los instrumentos de tipo ESEM. La marca ELECTROSCAN ESEM se obtuvo de forma intermitente hasta 1999, cuando se dejó que caducara. La palabra "ambiental" se introdujo originalmente como continuación del uso anterior (histórico) de células "ambientales" en microscopía de transmisión, aunque la palabra "atmosférico" también se ha utilizado para referirse a un ESEM a una atmósfera de presión (ASEM) [14 ] pero no con ningún instrumento comercial. Otros fabricantes competidores han utilizado los términos "SEM natural" [75] (Hitachi), "SEM húmedo" [76] (ISI), "Bio-SEM" (de corta duración, AMRAY), "VP-SEM" [77 ] (SEM de presión variable; LEO/Zeiss-SMT), “LVSEM” [78] (SEM de bajo vacío, que a menudo también denota SEM de bajo voltaje; [79] JEOL), todos los cuales parecen ser transitorios en el tiempo según a los programas de fabricación vigentes. Hasta hace poco, todos estos nombres se referían a instrumentos que funcionaban hasta unos 100 Pa y sólo con detectores de EEB. Últimamente, el Zeiss-SMT VP-SEM se ha ampliado a presiones más altas junto con una ionización gaseosa o centelleo gaseoso como mecanismo SE para la formación de imágenes. Por lo tanto, es inadecuado identificar el término ESEM con una sola marca de instrumento comercial en yuxtaposición con otras marcas comerciales (o de laboratorio) competidoras con nombres diferentes, ya que puede surgir cierta confusión debido al uso anterior de marcas comerciales.
De manera similar, el término GDD es genérico y cubre todo el novedoso principio de detección de gases en ESEM. Los términos ESD y GSED, en particular, se han utilizado junto con un ESEM comercial para indicar el modo de electrón secundario de este detector.
Los siguientes son ejemplos de imágenes tomadas con un ESEM.
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