El ensayo de metilación de Illumina que utiliza la plataforma Infinium I utiliza la tecnología 'BeadChip' [ se necesita aclaración ] para generar un perfil completo de la metilación del ADN humano en todo el genoma . Similar a la secuenciación con bisulfito y la pirosecuenciación , este método cuantifica los niveles de metilación en varios loci dentro del genoma . Este ensayo se utiliza para sondas de metilación en el BeadChip HumanMmethylation27 de Illumina Infinium (en adelante, matriz de 27k [metilación]). Las sondas en la matriz de 27k se dirigen a regiones del genoma humano para medir los niveles de metilación en 27.578 dinucleótidos CpG en 14.495 genes. [1] En 2008, Illumina lanzó la matriz Infinium HumanMethylation450 BeadChip (“matriz de 450 K”), que apunta a más de 450.000 sitios de metilación. [2] En 2016, se lanzó el Infinium MmethylationEPIC BeadChip ("EPIC"), que interroga más de 850.000 sitios de metilación en todo el genoma humano. [3]
La metilación del ADN juega un papel importante en la regulación epigenética de la estructura de la cromatina , que en la última década se ha reconocido que es importante en la regulación de la expresión genética , el desarrollo y la impronta genética en los vertebrados. [1] Se ha demostrado que los cambios en el patrón y el nivel de metilación contribuyen al cáncer y a diversas enfermedades del desarrollo. [4] Por ejemplo, la hipermetilación en las islas CpG promotoras de un gen supresor de tumores , que a su vez conduce a su silenciamiento , se asocia frecuentemente con la tumorgénesis . [4] Una medición a gran escala de los patrones de metilación del ADN de una amplia selección de genes puede permitirnos comprender mejor las relaciones entre los cambios epigenéticos y la génesis de diferentes enfermedades y una mejor comprensión del papel que desempeña la epigenética en la diferenciación específica de tejidos .
El chip de metilación Illumina 27k contiene 27.578 sitios CpG individuales, repartidos en 14.495 genes. [1] Estos genes incluyen genes RefSeq de la base de datos NCBI CCDS, genes de cáncer que muestran patrones de metilación diferenciales durante su curso de progresión y promotores de microARN. [5] Los marcadores incluidos en el chip se resumen en la Tabla 1. [5]
Para la tecnología química del ensayo Infinium I, el proceso se describe en la Figura 1.
Tratamiento con bisulfito
Se utiliza aproximadamente 1 μg de ADN genómico en la conversión con bisulfito para convertir la citosina no metilada en uracilo . El producto contiene citosina no convertida donde previamente estaban metiladas, pero citosina convertida en uracilo si previamente no estaban metiladas.
Amplificación de ADN genómico completo
El ADN tratado con bisulfito se somete a una amplificación de desplazamiento múltiple de todo el genoma mediante cebado hexámero aleatorio y ADN polimerasa Φ29 , que tiene una actividad de corrección que da como resultado tasas de error 100 veces menores que la polimerasa Taq . Luego, los productos se fragmentan enzimáticamente, [1] se purifican a partir de dNTP, cebadores y enzimas, y se aplican al chip. [6]
Hibridación y extensión de base única
En el chip, hay dos tipos de cuentas para cada sitio CpG ( o "CG" , según la Figura 1) por locus. Cada locus probado se diferencia por diferentes tipos de cuentas. [1] Ambos tipos de cuentas están unidos a oligonucleótidos de ADN monocatenarios de 50 unidades que difieren en secuencia sólo en el extremo libre; este tipo de sonda se conoce como oligonucleótido específico de alelo . Uno de los tipos de perlas corresponderá al locus de citosina metilada y el otro corresponderá al locus de citosina no metilada, que se convirtió en uracilo durante el tratamiento con bisulfito y luego se amplificó como timina durante la amplificación de todo el genoma. Los productos de ADN amplificados convertidos con bisulfito se desnaturalizan en cadenas simples y se hibridan con el chip mediante hibridación específica de alelo con la sonda específica de metilación o con la sonda de no metilación. A la hibridación le sigue la extensión de una sola base con didesoxinucleótidos marcados con hapteno . El ddCTP y el ddGTP están marcados con biotina, mientras que el ddATP y el ddUTP están marcados con 2,4-dinitrofenol (DNP). [7]
Tinción de fluorescencia y escaneo del chip Después de la incorporación de estos ddNTP marcados con hapteno, se realizan ensayos inmunohistoquímicos
multicapa mediante rondas repetidas de tinción con una combinación de anticuerpos para diferenciar los dos tipos. [7] Después de la tinción, el chip se escanea para mostrar las intensidades de los tipos de perlas metiladas y no metiladas. (Figura 2). [1] Los datos sin procesar se analizan mediante el software propietario y se calculan las relaciones de intensidad de fluorescencia entre los dos tipos de cuentas. Para un individuo determinado en un locus determinado, un valor de relación de 0 equivale a la no metilación del locus ( es decir , homocigoto no metilado); una proporción de 1 equivale a la metilación total ( es decir , homocigótica metilada); y un valor de 0,5 significa que una copia está metilada y la otra no ( es decir , heterocigosidad) en el genoma humano diploide. [ 15]
Análisis de los datos de metilación Las imágenes de microarrays
escaneadas de los datos de metilación son analizadas adicionalmente por el sistema, que normaliza los datos sin procesar para reducir los efectos de la variación experimental, el fondo y la normalización promedio, y realiza pruebas estadísticas estándar sobre los resultados. [8] Los datos luego se pueden compilar en varios tipos de figuras para su visualización y análisis. Se utilizan diagramas de dispersión para correlacionar los datos de metilación; diagramas de barras para visualizar niveles relativos de metilación en cada sitio analizado; mapas de calor para agrupar los datos y comparar el perfil de metilación en los sitios probados. La Figura 2 muestra los diferentes tipos de resultados generados.
Ventajas
Desventajas