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Tinción de Hoechst

Estructura química de los colorantes Hoechst

Las tinciones de Hoechst son parte de una familia de colorantes fluorescentes azules que se utilizan para teñir el ADN . [1] [2] Estas bis-benzimidas fueron desarrolladas originalmente por Hoechst AG , que numeró todos sus compuestos de modo que el colorante Hoechst 33342 es el compuesto número 33.342 fabricado por la empresa. Hay tres tinciones de Hoechst relacionadas: Hoechst 33258, Hoechst 33342 y Hoechst 34580. Los colorantes Hoechst 33258 y Hoechst 33342 son los más utilizados y tienen espectros de excitación - emisión similares .

Características moleculares

Espectros de excitación-emisión de colorantes Hoechst

Ambos colorantes se excitan con luz ultravioleta a alrededor de 350  nm , y ambos emiten luz fluorescente azul-cian alrededor de un espectro de emisión máximo a 461 nm. El colorante no unido tiene su máxima emisión de fluorescencia en el rango de 510-540 nm. Las tinciones de Hoechst se pueden excitar con una lámpara de arco de xenón o mercurio o con un láser ultravioleta . Existe un considerable desplazamiento de Stokes entre los espectros de excitación y emisión que hace que los colorantes de Hoechst sean útiles en experimentos en los que se utilizan múltiples fluoróforos . La intensidad de fluorescencia de los colorantes de Hoechst también aumenta con el pH del disolvente . [3]

Los colorantes Hoechst son solubles en agua y en disolventes orgánicos como la dimetilformamida o el dimetilsulfóxido . Se pueden alcanzar concentraciones de hasta 10 mg/ml. Las soluciones acuosas son estables a 2–6 °C durante al menos seis meses si se protegen de la luz. Para el almacenamiento a largo plazo, las soluciones se congelan a -20 °C o menos. [3]

Hoechst 33258 (magenta) unido al surco menor del ADN (verde y azul). De PDB : 264D .

Los colorantes se unen al surco menor del ADN bicatenario con preferencia por las secuencias ricas en adenina y timina . Aunque los colorantes pueden unirse a todos los ácidos nucleicos, las cadenas de ADN bicatenario ricas en AT mejoran considerablemente la fluorescencia. [4] Los colorantes Hoechst son permeables a las células y pueden unirse al ADN en células vivas o fijadas . Por lo tanto, estas tinciones a menudo se denominan supravitales , lo que significa que las células vivas sobreviven a un tratamiento con estos compuestos. Las células que expresan proteínas transportadoras de casete de unión a ATP específicas también pueden transportar activamente estas tinciones fuera de su citoplasma . [ cita requerida ]

Aplicaciones

Imagen de transmisión de células HeLa , con superposición de tinción Hoechst 33258 (azul). La célula más a la izquierda se encuentra en la etapa prometafásica de la mitosis ; sus cromosomas emiten una fluorescencia intensa porque contienen ADN altamente compactado.
Imagen fluorescente de neutrófilos cultivados aislados de sangre venosa de humanos con enfermedad de Alzheimer. La muestra fue tratada con el colorante Hoechst 33342 que se utiliza para teñir el ADN. La imagen muestra la liberación de ADN por un neutrófilo como un área borrosa en el centro del campo de visión que indica la activación espontánea de la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en pacientes con enfermedad de Alzheimer que no se observa habitualmente en compañeros sanos.

Se suele utilizar una concentración de 0,1 a 12 μg/ml para teñir el ADN en bacterias o células eucariotas . Las células se tiñen durante 1 a 30 minutos a temperatura ambiente o a 37 °C y luego se lavan para eliminar el colorante no unido. Se puede observar una fluorescencia verde del colorante Hoechst no unido en muestras que se tiñen con demasiado colorante o que se lavan parcialmente. [3] Los colorantes Hoechst se utilizan a menudo como sustitutos de otra tinción de ácidos nucleicos llamada DAPI .

Las diferencias clave entre los tintes Hoechst y DAPI son:

Hoechst 33342 y 33258 se extinguen con bromodesoxiuridina (BrdU), que se utiliza comúnmente para detectar células en división. Hoechst 33342 exhibe una permeabilidad celular 10 veces mayor que H 33258. Las células pueden integrar BrdU en ADN recién sintetizado como sustituto de la timidina . Cuando BrdU se integra en el ADN, se supone que el bromo deforma el surco menor de modo que los colorantes Hoechst no pueden alcanzar su sitio de unión óptimo. La unión de los colorantes Hoechst es incluso más fuerte al ADN sustituido con BrdU; sin embargo, no se produce fluorescencia. Los colorantes Hoechst se pueden utilizar con BrdU para monitorear la progresión del ciclo celular . [7] [8]

Los colorantes Hoechst se utilizan comúnmente para teñir el ADN genómico en las siguientes aplicaciones:

El eflujo de Hoechst también se utiliza para estudiar las células madre hematopoyéticas y embrionarias. Como estas células pueden expulsar eficazmente el colorante, se las puede detectar mediante citometría de flujo en lo que se denomina población lateral . Esto se hace pasando la fluorescencia emitida por el Hoechst excitado a través de filtros rojo y azul, y trazando el rojo y el azul del Hoechst uno contra el otro. [ cita requerida ]

Toxicidad y seguridad

Debido a que las tinciones de Hoechst se unen al ADN, interfieren en la replicación del ADN durante la división celular . En consecuencia, son potencialmente mutagénicas y cancerígenas , por lo que se debe tener cuidado al manipularlas y desecharlas. La tinción de Hoechst se utiliza para clasificar el esperma en el ganado y en los seres humanos. Su seguridad ha sido objeto de debate. [13] [14]

Véase también

Referencias

  1. ^ Latt, SA; Stetten, G; Juergens, LA; Willard, HF; Scher, CD (julio de 1975). "Avances recientes en la detección de la síntesis de ácido desoxirribonucleico mediante fluorescencia de Hoechst 33258". Journal of Histochemistry and Cytochemistry . 23 (7): 493–505. doi : 10.1177/23.7.1095650 . PMID  1095650.
  2. ^ Latt, SA; Stetten, G (enero de 1976). "Estudios espectrales sobre 33258 Hoechst y colorantes de bisbencimidazol relacionados útiles para la detección fluorescente de la síntesis de ácido desoxirribonucleico". Journal of Histochemistry and Cytochemistry . 24 (1): 24–33. doi : 10.1177/24.1.943439 . PMID  943439.
  3. ^ abc "Coloraciones de Hoechst" (PDF) . Invitrogren (Molecular Probes). Archivado desde el original (PDF) el 19 de abril de 2009.
  4. ^ Portugal, J; Waring, MJ (28 de febrero de 1988). "Asignación de sitios de unión de ADN para 4',6-diamidina-2-fenilindol y bisbencimiduro (Hoechst 33258). Un estudio comparativo de huellas dactilares". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Estructura y expresión génica . 949 (2): 158–68. doi :10.1016/0167-4781(88)90079-6. PMID  2449244.
  5. ^ BD Bioscience (2009). Técnicas para el análisis de la función inmunitaria (PDF) (2.ª ed.). Becton, Dickinson and Company.
  6. ^ Bucevičius, Jonás; Lukinavičius, Gražvydas; Gerasimaitė, Ruta (18 de abril de 2018). "El uso de tintes Hoechst para la tinción de ADN y más". Quimiosensores . 6 (2): 18. doi : 10.3390/chemosensors6020018 . hdl : 21.11116/0000-0001-A4FE-8 . ISSN  2227-9040.
  7. ^ Kubbies, M; Rabinovitch, PS (enero de 1983). "Análisis citométrico de flujo de los factores que influyen en el efecto de extinción de BrdUrd-Hoechst en fibroblastos y linfocitos humanos cultivados". Citometría . 3 (4): 276–81. doi : 10.1002/cyto.990030408 ​​. PMID  6185287.
  8. ^ Breusegem, SY; Clegg, RM; Loontiens, FG (1 de febrero de 2002). "Especificidad de la secuencia de bases de Hoechst 33258 y la unión de DAPI a cinco sitios de ADN (A/T)4 con evidencia cinética de más de un complejo Hoechst 33258-AATT de alta afinidad". Journal of Molecular Biology . 315 (5): 1049–61. doi :10.1006/jmbi.2001.5301. PMID  11827475.
  9. ^ Iain Johnson, Michelle TZ Spence, ed. (2011). Manual de sondas moleculares: una guía para sondas fluorescentes y tecnologías de etiquetado (11.ª ed.). Invitrogen. ISBN 978-0-9829279-1-5.
  10. ^ Kubbies, M (1990). "Reconocimiento mediante citometría de flujo del daño de la cromatina inducido por clastógeno en linfocitos G0/G1 mediante la unión no estequiométrica del fluorocromo de Hoechst". Citometría . 11 (3): 386–94. doi : 10.1002/cyto.990110309 . PMID  1692786.
  11. ^ ab Mocharla, R; Mocharla, H; Hodes, ME (23 de diciembre de 1987). "Una nueva técnica de tinción fluorométrica sensible para la detección de ADN en preparaciones de ARN". Nucleic Acids Research . 15 (24): 10589. doi :10.1093/nar/15.24.10589. PMC 339970 . PMID  2447564. 
  12. ^ Sterzel, W; Bedford, P; Eisenbrand, G (junio de 1985). "Determinación automatizada de ADN utilizando el fluorocromo Hoechst 33258". Analytical Biochemistry . 147 (2): 462–7. doi :10.1016/0003-2697(85)90299-4. PMID  2409841.
  13. ^ Ashwood-Smith, MJ (1994). "Seguridad de la selección de espermatozoides humanos mediante citometría de flujo". Reproducción humana . 9 (5). Oxford University Press : 757–759. doi :10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589. PMID  7929716.
  14. ^ Parrilla, I; Vázquez, JM; Cuello, C; Gil, MA; Roca, J; Di Berardino, D; Martínez, EA (2004). "La tinción Hoechst 33342 y la exposición al láser UV no inducen efectos genotóxicos en espermatozoides de verraco clasificados por flujo". Reproducción . 128 (5): 615–621. doi : 10.1530/rep.1.00288 . PMID  15509707.

Enlaces externos

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