Flow-FISH (hibridación in situ por fluorescencia) es una técnica citogenética para cuantificar el número de copias de ARN o elementos repetitivos específicos en el ADN genómico de poblaciones de células completas mediante la combinación de citometría de flujo con protocolos de tinción de hibridación in situ fluorescente citogenética . [1] [2] [3]
Flow-FISH se utiliza más comúnmente para cuantificar la longitud de los telómeros , que son tramos de ADN repetitivo (repeticiones TTAGGG hexaméricas) en los extremos distales de los cromosomas [4] en los glóbulos blancos humanos , y se utilizó un método semiautomático para hacerlo. publicado en Protocolos de la naturaleza . [1] La longitud de los telómeros en los glóbulos blancos ha sido un tema de interés porque la longitud de los telómeros en estos tipos de células (y también en otros tejidos somáticos ) disminuye gradualmente a lo largo de la vida humana, lo que resulta en senescencia celular , apoptosis , [5] o transformación . [6] Se ha demostrado que esta disminución es un marcador sustituto de la disminución concomitante en la longitud de los telómeros del conjunto de células madre hematopoyéticas , siendo el linaje de granulocitos el que ofrece la mejor indicación, presumiblemente debido a la ausencia de un subtipo de memoria de larga duración y comparativamente rápida renovación de estas células. [7]
Flow-FISH también es adecuado para la detección concomitante de ARN y proteínas . [2] Esto permite la identificación de células que no solo expresan un gen , sino que también lo traducen en proteína . Este tipo de Flow-FISH se ha utilizado para estudiar la infección latente de virus como el VIH-1 y el VEB , [8] [9] pero también para rastrear la expresión de genes unicelulares y su traducción en proteínas. [2] [10]
Flow-FISH fue publicado por primera vez en 1998 por Rufer et al. [11] como una modificación de otra técnica para analizar la longitud de los telómeros, Q-FISH , que emplea sondas de ácido nucleico peptídico [12] de una secuencia 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5' marcada con un fluoróforo de fluorescina para teñir repeticiones teloméricas en extensiones de metafase preparadas. de células que han sido tratadas con colcemid , shock hipotónico y fijación a portaobjetos mediante tratamiento con metanol / ácido acético [13] Las imágenes de las manchas fluorescentes resultantes podrían analizarse mediante un programa informático especializado para producir valores de fluorescencia cuantitativos que luego pueden usarse para estimar la longitud real de los telómeros. La fluorescencia producida por la tinción de la sonda se considera cuantitativa porque el PNA se une preferentemente al ADN en bajas concentraciones de sal iónica y en presencia de formamida , por lo que es posible que el dúplex de ADN no se reforme una vez que se ha fundido y recocido con la sonda de PNA , lo que permite que la sonda para saturar su secuencia repetida diana (ya que no es desplazada del ADN diana por el ADN antisentido que compite en la cadena complementaria), produciendo así una lectura confiable y cuantificable de la frecuencia de la diana de la sonda PNA en un sitio cromosómico determinado después de eliminar el sonda libre. [13]
A diferencia de Q-FISH, Flow-FISH utiliza las propiedades cuantitativas de la retención de la sonda PNA específica de los telómeros para cuantificar la fluorescencia media en una población de células, mediante el uso de un citómetro de flujo , en lugar de un microscopio de fluorescencia. [14] La principal ventaja de esta técnica es que elimina el tiempo necesario en Q-FISH para preparar extensiones en metafase de las células de interés, y que el análisis de citometría de flujo también es considerablemente más rápido que los métodos necesarios para adquirir y analizar Q-FISH preparado. diapositivas. Por lo tanto, Flow-FISH permite un análisis de mayor rendimiento de la longitud de los telómeros en los leucocitos sanguíneos, que son una forma fácilmente disponible de muestra de tejido humano. Las versiones más recientes de la técnica flow-FISH incluyen una población de control interno de timocitos de vaca con una longitud de telómero conocida detectada mediante TRF o análisis de fragmentos de restricción de telómero con los que se puede comparar la fluorescencia de una muestra desconocida determinada. Debido a que los timocitos de vaca absorben el tinte LDS751 en menor medida que sus homólogos humanos, se pueden diferenciar de forma fiable mediante el trazado y la selección de las poblaciones deseadas. Otros tipos de células que en el pasado no han demostrado ser buenos candidatos para flow-FISH pueden analizarse mediante la extracción de núcleos y la realización de la técnica directamente sobre ellos. [15]
