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El fraccionamiento por flujo de campo , abreviado FFF , [1] es una técnica de separación inventada por J. Calvin Giddings . La técnica se basa en la separación de sustancias coloidales o de alto peso molecular en soluciones líquidas, que fluyen a través de una plataforma de separación, que no tiene fase estacionaria . Es similar a la cromatografía líquida, ya que funciona con soluciones o suspensiones diluidas del soluto, transportadas por un eluyente fluido. La separación se consigue aplicando un campo (hidráulico, centrífugo, [2] térmico, [3] eléctrico, [4] magnético, [5] gravitacional,...) o de flujo cruzado, perpendicular a la dirección de transporte de la muestra. , que se bombea a través de un canal laminar largo y estrecho. El campo ejerce una fuerza sobre los componentes de la muestra, concentrándolos hacia una de las paredes del canal, lo que se denomina pared de acumulación. [6] La fuerza interactúa con una propiedad de la muestra, por lo que se produce la separación, es decir, los componentes muestran diferentes "movilidades" bajo la fuerza ejercida por el campo de cruce. Como ejemplo, para el método FFF hidráulico o de flujo cruzado, la propiedad que impulsa la separación es el coeficiente de difusión traslacional o el tamaño hidrodinámico. Para un campo térmico (que calienta una pared y enfría la otra), es la relación entre el coeficiente de difusión térmica y traslacional.
FFF es aplicable en el rango submicrónico (de 1 nm a varios micrones) en el modo "normal" o hasta 50 micrones en el llamado modo estérico [7] [8] . La transición del modo normal al modo estérico tiene lugar cuando la difusión se vuelve insignificante en tamaños superiores a una micra . FFF es único en su amplia gama dinámica de tamaños que cubren tanto macromoléculas solubles [9] como partículas o coloides que pueden separarse en un solo análisis.
Las aplicaciones típicas son polímeros y compuestos poliméricos de alta masa molar , nanopartículas , tanto industriales como ambientales, virus y partículas similares a virus, nanopartículas lipídicas, vesículas extracelulares y otros tipos de muestras biológicas.
FFF se puede acoplar a todos los tipos de detectores conocidos de HPLC o SEC. Debido a la similitud de la FFF con la cromatografía líquida, en la forma en que una fase móvil líquida pasa a través del canal, los detectores más comunes son los que también se utilizan para LC. El más utilizado es un detector UV-VIS, debido a su naturaleza no destructiva. El acoplamiento con dispersión de luz de múltiples ángulos permite calcular el tamaño de las fracciones eluidas y compararlos con los valores obtenidos mediante la teoría FFF. Otra detección específica popular es la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente para caracterizar nanopartículas metálicas con alta especificidad y sensibilidad.
FFF ofrece una separación física de muestras complejas y no homogéneas, que potencialmente no pueden caracterizarse mediante otros métodos de separación, como la cromatografía de exclusión por tamaño . Como no hay fase estacionaria, hay menos interacción con las superficies o los materiales de relleno de la columna. La separación se puede ajustar modulando la fuerza del campo de separación. FFF es un método suave y no ejerce tensión física sobre muestras frágiles, y la solución portadora se puede adaptar para lograr la mejor estabilidad de la muestra. FFF tiene una teoría bien elaborada, que puede usarse para encontrar condiciones de separación para alcanzar el resultado óptimo, sin una serie de experimentos de prueba y error. También es posible extraer información de los parámetros físicos de las fracciones de muestra de la teoría FFF, aunque casi todos los usuarios dependen principalmente de detectores de dispersión de luz para medir el tamaño de las fracciones de muestra eluidas.
FFF no funciona con moléculas pequeñas debido a su rápida difusión. Para una separación efectiva, la muestra debe concentrarse muy cerca de la pared de acumulación (una distancia inferior a 10 µm), lo que requiere que la velocidad de deriva causada por el campo de fuerza sea dos órdenes de magnitud mayor en comparación con el coeficiente de difusión. La intensidad de campo máxima que se puede generar en un canal FFF determina el rango de separación de tamaño más bajo. Para la instrumentación actual, esto es aproximadamente 1 nm.
Aunque FFF es una técnica extremadamente versátil, no existe un método único para todas las aplicaciones. Los diferentes métodos FFF necesitan instrumentación especializada. Actualmente sólo el llamado fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4) [10] ha ganado un uso generalizado. Otros métodos como el FFF centrífugo, térmico o eléctrico todavía tienen una existencia de nicho.
FFF se comporta de manera diferente a la cromatografía en columna y puede resultar contrario a la intuición para los usuarios de HPLC o SEC. Comprender el principio de funcionamiento de FFF es vital para una aplicación exitosa del método.
FFF fue ideado y publicado por primera vez por J. Calvin Giddings en 1966 [11] y en 1976. [1] Giddings había publicado muchos artículos sobre Flow-FFF [12] , que es la técnica FFF más importante en la actualidad. Giddings, a quien se le atribuye la invención del FFF, fue profesor de química y especialista en cromatografía y técnicas de separación en la Universidad de Utah .
Como se mencionó anteriormente, en el fraccionamiento por flujo de campo el campo puede ser hidráulico (con un flujo cruzado a través de una membrana semipermeable como pared de acumulación), gravitacional , centrífugo , térmico , eléctrico o magnético . En todos los casos, el mecanismo de separación se produce por diferencias en la movilidad de las partículas bajo las fuerzas del campo, en un equilibrio estacionario con las fuerzas de difusión : el campo induce una velocidad de deriva descendente y concentración hacia la pared de acumulación, la difusión actúa en contra de esto. gradiente de concentración. Después de un cierto tiempo (llamado tiempo de relajación), las dos fuerzas se equilibran en un equilibrio estacionario. Esto se visualiza mejor como una nube de partículas, con todos los componentes en constante movimiento, pero con una disminución exponencial de la concentración promedio que se aleja de la pared de acumulación hacia el canal. La disminución de la presión del aire al subir desde el nivel del mar tiene la misma disminución exponencial que se describe en la fórmula barométrica . Una vez lograda la relajación, comienza la elución cuando se activa el flujo del canal. En el canal delgado (altura típica de 250 a 350 µm) existe un perfil de velocidad de flujo laminar parabólico , que se caracteriza por un fuerte aumento de la velocidad del flujo al aumentar la distancia desde la pared de acumulación. Esto determina la velocidad de una partícula en particular, en función de su posición de equilibrio respecto de la pared del canal. Las partículas más cercanas a la pared de acumulación migrarán más lentamente en comparación con otras que se encuentran más arriba. La relación entre la velocidad de una especie de partícula y la velocidad promedio del fluido se llama relación de retención R. En FFF para una separación eficiente, R debe estar por debajo de 0,2; los valores típicos están en el rango de 0,02 a 0,1.
La separación en el fraccionamiento de flujo de campo se realiza en un canal laminar. Se compone de un bloque superior e inferior que están separados por un espaciador. El espaciador tiene un hueco recortado (rectangular o trapezoidal), que crea el volumen del canal a medida que el espaciador se sella entre los bloques. Alternativamente, el canal se puede fresar en el bloque superior como una cavidad. El canal está diseñado de manera que permita la aplicación del campo de fuerza, lo que significa que para cada método FFF se necesita un canal dedicado. La muestra se inyecta en una solución o suspensión diluida en el canal y se separa durante la migración desde la entrada a la salida a medida que la solución portadora se bombea a través del canal. Después de la salida del canal se colocan uno o varios detectores que analizan las fracciones eluidas.
Giddings y sus compañeros de trabajo han desarrollado una teoría que describe la ecuación de retención general que es común a todos los métodos FFF.
La relación entre el campo de fuerza separativo y el tiempo de retención se puede derivar de los primeros principios. Considere dos poblaciones de partículas dentro del canal FFF. El campo transversal impulsa ambas nubes de partículas hacia la pared de "acumulación" inferior. A este campo de fuerza se opone la difusión natural de las partículas, o movimiento browniano , que produce un movimiento contrario. Cuando estos dos procesos de transporte alcanzan el equilibrio, la concentración de partículas c se acerca a la función exponencial de elevación x sobre la pared de acumulación como se ilustra en la ecuación ( 1 ).
Representa la elevación característica de la nube de partículas. Esto se relaciona con la altura promedio que alcanza la nube de partículas dentro del canal y solo cuando el valor de es diferente para las poblaciones de partículas se producirá la separación. La fuerza de cada componente puede estar relacionada con la fuerza aplicada sobre cada partícula individual o con la relación entre el coeficiente de difusión D y la velocidad de deriva U. [13]
k es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta y F es la fuerza ejercida sobre una sola partícula por el campo de fuerza. Esto muestra cómo el valor de elevación característico depende inversamente de la fuerza aplicada. Por tanto, F gobierna el proceso de separación. Por lo tanto, variando la intensidad del campo se puede controlar la separación para alcanzar niveles óptimos.
La velocidad V de una nube de moléculas es simplemente la velocidad promedio de una distribución exponencial incrustada en un perfil de flujo parabólico.
El tiempo de retención, t r, se puede escribir como:
Donde L es la longitud del canal.
En FFF, la retención generalmente se expresa en términos de la relación de retención, que es el tiempo vacío t 0 (aparición de un trazador no retenido) dividido por el tiempo de retención t r . La ecuación de retención entonces queda:
donde se divide por w, el espesor o altura del canal. Sustituir kT/F en lugar de ilustra la relación de retención con respecto a la fuerza transversal aplicada.
Para una operación eficiente, el valor del espesor del canal w excede con creces . Cuando este es el caso, el término entre paréntesis se aproxima a la unidad. Por lo tanto, la ecuación 5 se puede aproximar como:
Por tanto, t r es aproximadamente proporcional a F. La separación de las bandas de partículas X e Y, representada por el incremento finito ∆t r en sus tiempos de retención, se logra sólo si el incremento de fuerza ∆F entre ellas es suficiente. Para que este sea el caso, se requiere un diferencial de fuerza de sólo 10 −16 N.
La magnitud de F y ∆F depende de las propiedades de las partículas, la intensidad del campo y el tipo de campo. Esto permite variaciones y adaptaciones de la técnica. A partir de este principio básico han evolucionado muchas formas de FFF que varían según la naturaleza de la fuerza de separación aplicada y el rango de tamaño de molécula al que se dirigen.
En FFF, la visualización de las señales del detector en función del tiempo se denomina fractograma, a diferencia del cromatograma de las técnicas de cromatografía en columna. El fractograma se puede convertir en un gráfico de distribución de una o varias propiedades físicas del analito utilizando la teoría FFF y/o señales del detector. Puede ser tamaño, masa molar, carga, etc.
A menudo, estas sustancias son partículas inicialmente suspendidas en un pequeño volumen de un tampón líquido y empujadas a lo largo del canal FFF por el tampón. Las velocidades variables de una especie particular de partículas pueden deberse a su tamaño, su masa y/o su distancia de las paredes de un canal con velocidad de flujo no uniforme. La presencia de diferentes especies en una muestra puede así identificarse mediante la detección de una propiedad común a cierta distancia a lo largo del canal largo, y mediante el fractograma resultante que indica la presencia de las diversas especies por picos, debido a los diferentes tiempos de llegada característicos de cada especie y sus propiedades físicas y químicas.
La mayoría de las técnicas disponibles hoy en día son avances de las creadas originalmente por el profesor Giddings hace casi cuatro décadas.
De estas técnicas, la FFF de flujo fue la primera que se ofreció comercialmente. Flow FFF separa partículas según su tamaño, independientemente de la densidad, y puede medir macromoléculas en el rango de 1 nm a 1 µm. En este sentido, es la subtécnica FFF más versátil disponible. El flujo cruzado en Flow FFF ingresa a través de una frita porosa en la parte superior del canal y sale a través de una frita de salida de membrana semipermeable en la pared de acumulación (es decir, la pared inferior). El flujo simétrico ha sido reemplazado por el flujo asimétrico en las últimas dos décadas.
El flujo de fibra hueca FFF (HF5) fue desarrollado por Lee et al . (1974). [14] HF5 se ha aplicado al análisis de proteínas y otras macromoléculas. HF5 fue la primera forma de flujo FFF que se desarrolló en 1974. La ventaja es que HF5 ofrece una unidad de canal desechable que puede reemplazarse fácilmente en aplicaciones de rutina. Uno de los inconvenientes del HF5 es la elección limitada de materiales de membrana; Sólo están disponibles membranas de poliéter sulfona (PES). Actualmente, HF5 no se utiliza ampliamente debido a la falta de flexibilidad y limitaciones en la carga de muestra.
El flujo asimétrico FFF ( AF4 ), por otro lado, tiene solo una membrana semipermeable en la pared inferior del canal. Por lo tanto, el flujo cruzado lo crea el líquido portador que sale del fondo del canal. Esto ofrece una separación extremadamente suave y un rango de separación "ultra amplio". La mayoría de los instrumentos FFF en uso son sistemas AF4. Las principales aplicaciones se encuentran en la investigación y el desarrollo farmacéutico de proteínas, virus y partículas similares a virus, y liposomas. AF4 se puede aplicar en disolventes acuosos y orgánicos, por lo que también se pueden separar polímeros orgánicos mediante esta técnica.
El fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico de alta temperatura está disponible para la separación de polímeros de masa molar alta y ultraalta solubles a temperaturas superiores a 150 C.
El FFF térmico, como su nombre indica, establece una fuerza de separación aplicando un gradiente de temperatura al canal. La pared superior del canal se calienta y la pared inferior se enfría impulsando polímeros y partículas hacia la pared fría mediante difusión térmica. Thermal FFF se desarrolló como una técnica para separar polímeros sintéticos en disolventes orgánicos. La FFF térmica es única entre las técnicas de FFF porque puede separar macromoléculas tanto por masa molar como por composición química, lo que permite la separación de fracciones de polímero con el mismo peso molecular. Hoy en día, esta técnica es ideal para la caracterización de polímeros, geles y nanopartículas.
Una de las principales ventajas de Thermal FFF son las dimensiones simples y muy bien definidas del canal de separación, lo que hace posible la calibración universal entre laboratorios o entre instrumentos porque las constantes de calibración de Thermal FFF describen de cerca la relación de difusión ordinaria (molecular). coeficiente D al coeficiente de difusión térmica (o movilidad termoforética) D T que dependen únicamente del polímero. Por lo tanto, la Calibración Universal ThFFF es transferible al instrumento y al laboratorio, mientras que la conocida Calibración Universal de cromatografía de exclusión por tamaño es transferible por polímero en el mismo instrumento únicamente. [15]
El fraccionamiento de celdas delgadas de flujo dividido (SPLITT) [16] es una técnica preparativa especial de FFF, que utiliza gravedad [17] o electricidad, [18] o diferencias de difusión para la separación de partículas de tamaño superior a µm de forma continua. El sistema SPLITT tiene dos entradas y dos salidas. Se realiza bombeando la muestra sumergida en un líquido a una entrada al inicio del canal a un caudal bajo, mientras que simultáneamente se bombea un líquido portador a la segunda entrada a un caudal mucho mayor. Al controlar las relaciones de caudal de las dos corrientes de entrada y las dos corrientes de salida, se puede controlar la separación y los componentes de la muestra se separan en dos fracciones de distintos tamaños. El uso de la gravedad únicamente como fuerza de separación hace que SPLITT sea la técnica FFF menos sensible, limitada a partículas superiores a 1 µm.
En el FFF centrífugo, el campo de separación se genera mediante una fuerza centrífuga. El canal tiene la forma de un anillo que gira a velocidades de rotación que se pueden programar durante el recorrido. El flujo y la muestra se bombean al canal y se centrifugan, lo que permite al operador resolver las partículas por masa (tamaño y densidad). La ventaja del FFF centrífugo radica en la alta resolución de tamaño que se puede lograr variando la fuerza aplicada, ya que el tamaño de las partículas es proporcional a la masa de las partículas a la tercera potencia.
La ventaja única que presenta la FFF centrífuga proviene de la capacidad de la técnica para obtener alta resolución dada una densidad de flotación suficiente. Esto permite la separación de partículas con solo un 5% de diferencia de tamaño.
La FFF centrífuga tiene la ventaja de que las partículas y macromoléculas se pueden separar por densidad de partícula, en lugar de solo por tamaño de partícula. En este caso, dos nanopartículas de oro y plata de tamaño idéntico se pueden separar en dos picos, según las diferencias de densidad de las nanopartículas de oro y plata.
En las separaciones AF4, la relación masa-tiempo es 1:1. Con la adición del tercer parámetro de densidad a la FFF centrífuga, esto produce una relación más parecida a masa:tiempo elevada a la potencia de tres. Esto da como resultado una distinción significativamente mayor entre picos y una resolución muy mejorada. Esto puede resultar particularmente útil para productos novedosos, como materiales compuestos y polímeros recubiertos que contienen nanopartículas, es decir, partículas que pueden no variar en tamaño pero sí en densidad. De esta manera, dos partículas del mismo tamaño aún pueden separarse en dos picos, siempre que la densidad sea diferente.
La limitación del método radica en el límite inferior de tamaño que depende de la densidad de la muestra. Específicamente para muestras biológicas, el límite es del orden de 20 a 50 nm de diámetro.
En la FFF eléctrica se aplica una corriente eléctrica transversal (CC) que crea un campo eléctrico. Dependiendo de la carga de los componentes de la muestra, se induce una velocidad de deriva electroforética , contrarrestada por la difusión del movimiento browniano, por lo que la separación depende de la proporción de movilidad y tamaño electroforético. La aplicación del FFF eléctrico ha sido limitada y actualmente rara vez se utiliza. Se han desarrollado otras modificaciones, concretamente el FFF eléctrico cíclico en el que se aplica una corriente alterna especial. Permite separar según la movilidad electroforética. Otra variación es el flujo eléctrico asimétrico FFF (EAF4), donde se aplica un campo eléctrico además de un campo de flujo cruzado. EAF4 supera la limitación del FFF eléctrico puro, que tiene una resolución deficiente y sufre de productos de electrólisis y burbujas que contaminan el flujo de salida del canal y comprometen las señales del detector. [19]
