La mezcla de ADN , también conocida como reproducción molecular, es un método de recombinación aleatoria in vitro para generar genes mutantes para la evolución dirigida y permitir un rápido aumento en el tamaño de la biblioteca de ADN . [1] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] Tres procedimientos para lograr la mezcla de ADN son el mejoramiento molecular que se basa en la recombinación homóloga o la similitud de las secuencias de ADN, las enzimas de restricción que dependen en sitios de restricción comunes y recombinación aleatoria no homóloga que requiere el uso de horquillas . [1] En todas estas técnicas, los genes originales se fragmentan y luego se recombinan. [1] [4]
La mezcla de ADN utiliza recombinación aleatoria en lugar de mutagénesis dirigida para generar proteínas con atributos únicos o combinaciones de características deseables codificadas en los genes originales, como termoestabilidad y alta actividad. [1] [8] El potencial de la mezcla de ADN para producir nuevas proteínas se ejemplifica en la figura que se muestra a la derecha, que demuestra la diferencia entre mutaciones puntuales, inserciones y eliminaciones, y la mezcla de ADN. [1] Específicamente, esta figura muestra el uso de la mezcla de ADN en dos genes parentales que permite la generación de proteínas recombinantes que tienen una combinación aleatoria de secuencias de cada gen parental. [1] Esto es distinto de las mutaciones puntuales en las que se ha cambiado, insertado o eliminado un nucleótido y de las inserciones o eliminaciones en las que se ha agregado o eliminado una secuencia de nucleótidos, respectivamente. [1] [2] Como resultado de la recombinación aleatoria, la mezcla de ADN puede producir proteínas con nuevas cualidades o múltiples características ventajosas derivadas de los genes originales. [1] [4]
En 1994, Willem PC Stemmer publicó el primer artículo sobre la mezcla de ADN. [7] Desde la introducción de la técnica, la mezcla de ADN se ha aplicado a proteínas y productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, biorremediación , vacunas , terapia génica y virus evolucionados. [3] [10] [11] [12] Otras técnicas que producen resultados similares a la mezcla de ADN incluyen la quimeragénesis aleatoria en plantillas transitorias (RACHITT), la recombinación in vitro de impresión aleatoria (RPR) y el proceso de extensión escalonada (StEP). [4] [7] [13]
La mezcla de ADN mediante reproducción molecular fue reportada por primera vez en 1994 por Willem PC Stemmer. [1] [7] Comenzó fragmentando el gen de la β-lactamasa que había sido amplificado con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando DNasa I , que escinde aleatoriamente el ADN. [14] [15] Luego completó una reacción de PCR modificada donde no se emplearon cebadores, lo que resultó en la hibridación de fragmentos homólogos o fragmentos con secuencias similares. [14] Finalmente, estos fragmentos fueron amplificados por PCR. [14] Stemmer informó que el uso de mezcla de ADN en combinación con retrocruzamiento dio como resultado la eliminación de mutaciones no esenciales y un aumento en la producción del antibiótico cefotaxima . [14] También enfatizó el potencial de la evolución molecular con la mezcla del ADN. [16] Específicamente, indicó que la técnica podría usarse para modificar proteínas. [dieciséis]
Desde entonces, la mezcla de ADN se ha aplicado para generar bibliotecas de genes híbridos o quiméricos y ha inspirado la mezcla familiar, que se define como el uso de genes relacionados en la mezcla de ADN. [17] [18] [19] Además, la mezcla de ADN se ha aplicado a proteínas y productos farmacéuticos de moléculas pequeñas, biorremediación, terapia génica, vacunas y virus evolucionados. [3] [10] [11] [12] [20]
En primer lugar, la ADNasa I se utiliza para fragmentar un conjunto de genes originales en segmentos de ADN bicatenario que van desde 10-50 pb hasta más de 1 kpb. [4] [16] A esto le sigue una PCR sin cebadores. [14] En la PCR, los fragmentos de ADN con secuencias suficientemente superpuestas se fusionarán entre sí y luego se extenderán mediante la ADN polimerasa . [1] [4] [5] [7] [14] [16] [21] La extensión por PCR no se producirá a menos que existan secuencias de ADN de alta similitud. [1] Los factores importantes que influyen en las secuencias sintetizadas en la mezcla de ADN son la ADN polimerasa, las concentraciones de sal y la temperatura de recocido. [10] Por ejemplo, el uso de la polimerasa Taq para la amplificación de un fragmento de 1 kpb en una PCR de 20 ciclos da como resultado que entre el 33% y el 98% de los productos contengan una o más mutaciones. [21]
Se pueden utilizar múltiples ciclos de extensión por PCR para amplificar los fragmentos. [1] [4] [5] [7] [14] [16] [21] La adición de cebadores que están diseñados para ser complementarios a los extremos de los fragmentos extendidos se agregan para amplificar aún más las secuencias con otra PCR. [1] [14] [21] Se pueden elegir cebadores para que tengan secuencias adicionales agregadas a sus extremos 5', como secuencias para sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que son necesarios para la ligación en un vector de clonación . [1] [14]
Es posible recombinar porciones de los genes originales para generar híbridos o formas quiméricas con propiedades únicas, de ahí el término mezcla de ADN. [22] La desventaja del mejoramiento molecular es el requisito de similitud entre las secuencias, lo que ha inspirado el desarrollo de otros procedimientos para la mezcla de ADN. [1]
Se emplean enzimas de restricción para fragmentar los genes originales. [1] [21] Los fragmentos luego se unen mediante ligación que se puede lograr con ADN ligasa . [1] Por ejemplo, si dos genes parentales tienen tres sitios de restricción, se pueden crear catorce híbridos de genes de longitud completa diferentes. [1] El número de híbridos únicos de longitud completa está determinado por el hecho de que un gen con tres sitios de restricción se puede dividir en cuatro fragmentos . [1] Por lo tanto, hay dos opciones para cada una de las cuatro posiciones menos las combinaciones que recrearían los dos genes parentales, lo que produciría 2 4 - 2 = 14 genes híbridos de longitud completa diferentes . [1]
La principal diferencia entre la mezcla de ADN con enzimas de restricción y el mejoramiento molecular es que el mejoramiento molecular se basa en la homología de las secuencias para el hibridación de las cadenas y la PCR para la extensión, mientras que al usar enzimas de restricción, se crean extremos de fragmentos que se pueden ligar. [1] Las principales ventajas del uso de enzimas de restricción incluyen el control sobre el número de eventos de recombinación y la falta de requisitos de amplificación por PCR. [1] [23] La principal desventaja es el requisito de sitios de enzimas de restricción comunes. [1]
Para generar segmentos que van desde 10-50 pb hasta más de 1 kb, se utiliza DNasa I. [4] [16] [24] Los extremos de los fragmentos se vuelven romos añadiendo ADN polimerasa T4. [1] [24] Despuntar los fragmentos es importante para combinarlos, ya que los extremos adhesivos incompatibles o los salientes impiden la unión de los extremos. [1] [25] [26] Luego se añaden horquillas con un sitio de restricción específico a la mezcla de fragmentos. [1] [24] A continuación, se emplea ADN ligasa T4 para ligar los fragmentos y formar secuencias extendidas. [1] [24] La ligadura de las horquillas a los fragmentos limita la longitud de las secuencias extendidas al evitar la adición de más fragmentos. [1] Finalmente, para eliminar los bucles en horquilla, se utiliza una enzima de restricción. [1] [24]
La recombinación aleatoria no homóloga difiere del mejoramiento molecular en que la homología de las secuencias ligadas no es necesaria, lo cual es una ventaja. [1] Sin embargo , debido a que este proceso recombina los fragmentos aleatoriamente, es probable que una gran fracción de las secuencias de ADN recombinadas no tengan las características deseadas, lo cual es una desventaja. [1] La recombinación aleatoria no homóloga también difiere del uso de enzimas de restricción para la mezcla de ADN, ya que no se requieren sitios de enzimas de restricción comunes en los genes originales y el uso de horquillas es necesario, lo que demuestra una ventaja y desventaja de la recombinación aleatoria no homóloga sobre el uso de enzimas de restricción, respectivamente. [1]
Dado que la mezcla del ADN permite la recombinación de genes, se pueden mejorar las actividades de las proteínas. [3] [20] Por ejemplo, la mezcla de ADN se ha utilizado para aumentar la potencia de los interferones recombinantes presentados en fagos en células murinas y humanas. [3] Además, la mejora de la proteína verde fluorescente (GFP) se logró mediante la mezcla de ADN mediante reproducción molecular, ya que se obtuvo una señal 45 veces mayor que el estándar para la fluorescencia de células completas. [20] Además, la síntesis de diversos genes también puede dar como resultado la producción de proteínas con atributos novedosos. [1] Por lo tanto, la mezcla de ADN se ha utilizado para desarrollar proteínas para desintoxicar sustancias químicas. [3] [27] Por ejemplo, el método de recombinación homóloga de mezcla de ADN mediante reproducción molecular se ha utilizado para mejorar la desintoxicación de atrazina y arseniato . [3] [27]
La mezcla de ADN también se ha utilizado para mejorar la degradación de contaminantes biológicos. [12] [28] Específicamente, se ha creado una cepa recombinante de E. coli con el uso de mezcla de ADN mediante reproducción molecular para la biorremediación de tricloroetileno (TCE), un carcinógeno potencial , que es menos susceptible a los intermediarios epóxidos tóxicos. [12] [21] [28]
La capacidad de seleccionar recombinantes deseables con mezcla de ADN se ha utilizado en combinación con estrategias de detección para mejorar las vacunas candidatas contra infecciones con énfasis en mejorar la inmunogenicidad , la producción de vacunas, la estabilidad y la reactividad cruzada con múltiples cepas de patógenos. [3] [10] Se han investigado algunas vacunas candidatas para Plasmodium falciparum , el virus del dengue , los alfavirus encefalíticos (incluidos: VEEV , WEEV y EEEV ), el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) y el virus de la hepatitis B (VHB). . [10]
Los requisitos para las terapias genéticas humanas incluyen alta pureza, títulos altos y estabilidad. [11] La mezcla de ADN permite la fabricación de vectores retrovirales con estos atributos. [11] Por ejemplo, se aplicó la mezcla de ADN con reproducción molecular a seis cepas del virus de la leucemia murina ecotrópica (MLV), lo que dio como resultado la compilación de una extensa biblioteca de retrovirus recombinantes y la identificación de múltiples clones con mayor estabilidad. [11] Además, se empleó la aplicación de mezcla de ADN mediante reproducción molecular en múltiples vectores de virus adenoasociados (AAV) originales para generar una biblioteca de diez millones de quimeras. [29] Los atributos ventajosos obtenidos incluyen una mayor resistencia a la inmunoglobulina intravenosa humana (IGIV) y la producción de tropismo celular en los nuevos virus. [29]
Si bien la mezcla de ADN se ha convertido en una técnica útil para la recombinación aleatoria, también se han desarrollado para este propósito otros métodos, incluidos RACHITT, RPR y StEP. [4] [13] A continuación se presentan algunas ventajas y desventajas de estos otros métodos de recombinación. [4] [7] [13]
En RACHITT, los fragmentos de genes parentales monocatenarios (ss) se hibridan en una plantilla ss, lo que da como resultado una menor falta de coincidencia, lo cual es una ventaja. [13] Además, RACHIIT permite que se recombinen genes con baja similitud de secuencia. [7] Sin embargo, una desventaja importante es la preparación de los fragmentos ss de los genes originales y la plantilla ss. [7] [13]
RPR utiliza cebadores aleatorios. [30] Estos cebadores aleatorios se hibridan con el ADN molde y luego se extienden mediante el fragmento Klenow . [30] A continuación, se retiran las plantillas y los fragmentos se ensamblan por homología en un proceso similar a la PCR. [30] Algunos beneficios importantes incluyen el menor requerimiento de genes parentales debido al uso de plantillas ss y una mayor diversidad de secuencias por cebado incorrecto e incorporación errónea. [7] [30] Una desventaja de RPR es la preparación de la plantilla. [30]
En StEP, se emplean ciclos breves de hibridación del cebador con una plantilla y extensión mediante polimerasa para generar secuencias de longitud completa. [31] [32] Las principales ventajas de StEP son la simplicidad del método y la falta de purificación de fragmentos. [7] [13] Las desventajas de StEP incluyen que requiere mucho tiempo y homología de secuencia. [7] [13]
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