La cromatografía de permeación en gel ( GPC ) [1] es un tipo de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), que separa analitos coloidales o de alto peso molecular en función del tamaño o diámetro, generalmente en disolventes orgánicos. La técnica se utiliza a menudo para el análisis de polímeros . Como técnica, la SEC fue desarrollada por primera vez en 1955 por Lathe y Ruthven. [2] El término cromatografía de permeación en gel se remonta a JC Moore de Dow Chemical Company , quien investigó la técnica en 1964. [3] La tecnología de columna patentada fue licenciada a Waters Corporation , quien posteriormente comercializó esta tecnología en 1964. [4 ] Los sistemas y consumibles GPC ahora también están disponibles de varios fabricantes. Muchas veces es necesario separar polímeros, tanto para analizarlos como para purificar el producto deseado.
Al caracterizar polímeros, es importante considerar su distribución de tamaño y dispersidad ( Đ ), así como su peso molecular . Los polímeros se pueden caracterizar mediante una variedad de definiciones de peso molecular, incluido el peso molecular promedio en número (Mn ) , el peso molecular promedio en peso (Mw ) (ver distribución de masa molar ), el peso molecular promedio en tamaño (Mz ) , o el peso molecular de la viscosidad (Mv ) . GPC permite la determinación de Đ así como de Mv y , basándose en otros datos, se pueden determinar Mn , Mw y Mz .
GPC es un tipo de cromatografía en la que los analitos se separan en función de su tamaño o volumen hidrodinámico ( radio de giro ). Esto difiere de otras técnicas cromatográficas, que dependen de interacciones químicas o físicas entre las fases móvil y estacionaria para separar los analitos. [5] La separación se produce mediante el uso de perlas de gel porosas empaquetadas dentro de una columna (ver fase estacionaria (química) ). El principio de separación se basa en la exclusión o inclusión diferencial de las macromoléculas por la fase estacionaria del gel poroso. Las moléculas más grandes no pueden entrar en los poros y eluir antes, mientras que las moléculas más pequeñas pueden entrar en los poros, permaneciendo así más tiempo dentro de la columna. Todo el proceso se desarrolla sin interacción de los analitos con la superficie de la fase estacionaria.
Los analitos más pequeños en relación con el tamaño de los poros pueden penetrar estos poros y pasar más tiempo dentro de las partículas de gel, aumentando su tiempo de retención. Por el contrario, los analitos más grandes en relación con el tamaño de los poros pasan poco o ningún tiempo dentro de la columna, por lo que eluyen antes. Cada tipo de columna tiene un rango de pesos moleculares que se pueden separar, según el tamaño de sus poros.
Si un analito es demasiado grande en relación con los poros de la columna, no se retendrá en absoluto y quedará totalmente excluido; por el contrario, si el analito es pequeño en relación con el tamaño de los poros, será totalmente permeable. Los analitos que están totalmente excluidos, eluyen con el volumen libre exterior alrededor de las partículas (V o ), el límite de exclusión total, mientras que los analitos que están completamente retrasados, eluyen con el disolvente, marcando el volumen total de permeación de la columna, incluyendo también el disolvente. mantenido dentro de los poros (V i ). El volumen total se puede considerar mediante la siguiente ecuación, donde V g es el volumen del gel polimérico y V t es el volumen total: [5]
Como se puede inferir, existe un rango limitado de pesos moleculares que pueden separarse mediante cada columna, por lo que el tamaño de los poros para el empaquetamiento debe elegirse de acuerdo con el rango de pesos moleculares de los analitos a separar. Para separaciones de polímeros, los tamaños de poro deben ser del orden de los polímeros que se analizan. Si una muestra tiene un amplio rango de pesos moleculares, puede ser necesario utilizar varias columnas de GPC con diferentes volúmenes de poros en conjunto para resolver completamente la muestra.
La GPC se utiliza a menudo para determinar el peso molecular relativo de muestras de polímeros, así como la distribución de pesos moleculares. Lo que GPC realmente mide es el volumen molecular y la función de forma definida por la viscosidad intrínseca . Si se utilizan estándares comparables, estos datos relativos se pueden utilizar para determinar los pesos moleculares con una precisión de ± 5 %. Normalmente se utilizan estándares de poliestireno con dispersidades inferiores a 1,2 para calibrar el GPC. [6] Desafortunadamente, el poliestireno tiende a ser un polímero muy lineal y, por lo tanto, como estándar sólo es útil compararlo con otros polímeros que se sabe que son lineales y de relativamente el mismo tamaño.
La cromatografía de permeación en gel se realiza casi exclusivamente en sistemas de cromatografía . El diseño experimental no difiere mucho de otras técnicas de cromatografía líquida de alta resolución . Las muestras se disuelven en un disolvente apropiado, en el caso de GPC suelen ser disolventes orgánicos y después de filtrar la solución se inyecta en una columna. La separación de la mezcla de varios componentes se realiza en la columna. El suministro constante de eluyente fresco a la columna se logra mediante el uso de una bomba. Dado que la mayoría de los analitos no son visibles a simple vista, se necesita un detector. A menudo se utilizan varios detectores para obtener información adicional sobre la muestra de polímero. La disponibilidad de un detector hace que el fraccionamiento sea cómodo y preciso.
Los geles se utilizan como fase estacionaria para GPC. El tamaño de los poros de un gel debe controlarse cuidadosamente para poder aplicar el gel a una separación determinada. Otras propiedades deseables del agente formador de gel son la ausencia de grupos ionizantes y, en un disolvente determinado, una baja afinidad por las sustancias que se van a separar. Geles comerciales como PLgel y Styragel (poliestireno-divinilbenceno reticulado), [7] [8] LH-20 ( Sephadex hidroxipropilado ), [9] Bio-Gel ( poliacrilamida reticulada ), HW-20 y HW-40 ( polímero metacrílico hidroxilado ), [10] y gel de agarosa se utilizan a menudo en función de diferentes requisitos de separación. [11]
La columna utilizada para GPC está llena de un material de relleno microporoso. La columna se llena con el gel. Dado que el volumen total de penetración es el volumen máximo permeado por los analitos y no hay retención en la superficie de la fase estacionaria, el volumen total de la columna suele ser grande, en relación con el volumen de la muestra.
El eluyente (fase móvil) debe ser el solvente apropiado para disolver el polímero, no debe interferir con la respuesta del polímero analizado y debe humedecer la superficie del empaque y volverla inerte a las interacciones con los polímeros. Los eluyentes más comunes para polímeros que se disuelven a temperatura ambiente GPC son tetrahidrofurano (THF), o -diclorobenceno y triclorobenceno a 130-150 °C para polialquinos cristalinos y hexafluoroisopropanol (HFIP) para polímeros de condensación cristalinos como poliamidas y poliésteres . [12]
Hay dos tipos de bombas disponibles para la entrega uniforme de volúmenes de líquido relativamente pequeños para GPC: bombas de pistón o peristálticas. La entrega de un flujo constante libre de fluctuaciones es especialmente importante para la precisión del análisis GPC, ya que el caudal se utiliza para la calibración del peso molecular o diámetro. [13]
En GPC, la concentración en peso de polímero en el disolvente eluyente se puede controlar continuamente con un detector. Hay muchos tipos de detectores disponibles y se pueden dividir en dos categorías principales. El primero son los detectores sensibles a la concentración, que incluyen detectores de absorción UV-VIS, refractómetro diferencial (DRI) o índice de refracción (RI), detectores de densidad y absorción infrarroja (IR). La segunda categoría son los detectores sensibles al peso molecular, que incluyen detectores de dispersión de luz de ángulo bajo (LALLS) y detectores de dispersión de luz de múltiples ángulos (MALLS). [14] El cromatograma resultante es, por tanto, una distribución de peso del polímero en función del volumen de retención.
El detector más sensible es el fotómetro diferencial de UV y el detector más común es el refractómetro diferencial (DRI). Al caracterizar copolímeros, es necesario tener dos detectores en serie. [6] Para determinaciones precisas de la composición del copolímero, al menos dos de esos detectores deben ser detectores de concentración. [14] La determinación de la mayoría de las composiciones de copolímeros se realiza utilizando detectores UV y RI, aunque se pueden utilizar otras combinaciones. [15]
La cromatografía de permeación en gel (GPC) se ha convertido en la técnica más utilizada para analizar muestras de polímeros con el fin de determinar sus pesos moleculares y distribuciones de peso. A la izquierda se muestran ejemplos de cromatogramas GPC de muestras de poliestireno con sus pesos moleculares y dispersidades .
Benoit y colaboradores [16] propusieron que el volumen hidrodinámico, V η , que es proporcional al producto de [η] y M, donde [η] es la viscosidad intrínseca del polímero en el eluyente SEC, puede usarse como el parámetro de calibración universal. Si se conocen las constantes K y α de Mark-Houwink-Sakurada (consulte la ecuación de Mark-Houwink ), una gráfica de log [η]M versus el volumen de elución (o tiempo de elución) para un disolvente, columna e instrumento en particular proporciona una curva de calibración universal. que se puede utilizar para cualquier polímero en ese disolvente. Al determinar los volúmenes (o tiempos) de retención de estándares de polímeros monodispersos (por ejemplo, soluciones de poliestireno monodisperso en THF), se puede obtener una curva de calibración trazando el logaritmo del peso molecular versus el tiempo o volumen de retención. Una vez obtenida la curva de calibración, se puede obtener el cromatograma de permeación en gel de cualquier otro polímero en el mismo disolvente y se pueden determinar los pesos moleculares (normalmente Mn y Mw ) y la distribución completa del peso molecular del polímero. A la derecha se muestra una curva de calibración típica y el peso molecular de una muestra desconocida se puede obtener a partir de la curva de calibración.
Como técnica de separación, GPC tiene muchas ventajas. En primer lugar, tiene un tiempo de separación bien definido debido a que existe un volumen de elución final para todos los analitos no retenidos. Además, la GPC puede proporcionar bandas estrechas, aunque este aspecto de la GPC es más difícil para muestras de polímeros que tienen amplios rangos de pesos moleculares presentes. Finalmente, dado que los analitos no interactúan química o físicamente con la columna, existe una menor probabilidad de que se produzca una pérdida de analitos. [5] Para investigar las propiedades de muestras de polímeros en particular, la GPC puede resultar muy ventajosa. GPC proporciona un método más conveniente para determinar los pesos moleculares de los polímeros. De hecho, la mayoría de las muestras se pueden analizar exhaustivamente en una hora o menos. [17] Otros métodos utilizados en el pasado fueron la extracción fraccionada y la precipitación fraccionada. Como estos procesos requerían bastante mano de obra, los pesos moleculares y las distribuciones de masa generalmente no se analizaban. [18] Por lo tanto, GPC ha permitido la estimación rápida y relativamente fácil de los pesos moleculares y la distribución de muestras de polímeros.
Sin embargo, GPC tiene desventajas. En primer lugar, existe un número limitado de picos que pueden resolverse en el corto plazo de ejecución del GPC. Además, como técnica, la GPC requiere alrededor de al menos un 10% de diferencia en el peso molecular para que se produzca una resolución razonable de los picos. [5] En lo que respecta a los polímeros, las masas moleculares de la mayoría de las cadenas serán demasiado cercanas para que la separación por GPC muestre algo más que picos amplios. Otra desventaja del GPC para polímeros es que se deben realizar filtraciones antes de usar el instrumento para evitar que el polvo y otras partículas arruinen las columnas e interfieran con los detectores. Aunque es útil para proteger el instrumento, existe la posibilidad de que la prefiltración de la muestra elimine la muestra de mayor peso molecular antes de que pueda cargarse en la columna. Otra posibilidad para superar estos problemas es la separación mediante fraccionamiento del flujo de campo (FFF).
El fraccionamiento de flujo de campo (FFF) se puede considerar como una alternativa al GPC, especialmente cuando las partículas o los polímeros de alta masa molar causan obstrucción de la columna, la degradación por cizallamiento es un problema o se produce una aglomeración pero no puede hacerse visible. FFF es la separación en un canal de flujo abierto sin que intervenga una fase estática, por lo que no se producen interacciones. Con una versión de fraccionamiento de flujo de campo, el fraccionamiento térmico de flujo de campo , es posible la separación de polímeros que tienen el mismo tamaño pero diferentes composiciones químicas. [19]
