La secuenciación metagenómica clínica de próxima generación ( mNGS ) es el análisis exhaustivo del material genético microbiano y del huésped ( ADN o ARN ) en muestras clínicas de pacientes mediante secuenciación de próxima generación . Utiliza las técnicas de la metagenómica para identificar y caracterizar el genoma de bacterias , hongos , parásitos y virus sin la necesidad de un conocimiento previo de un patógeno específico directamente a partir de muestras clínicas. La capacidad de detectar todos los patógenos potenciales en una muestra hace que la secuenciación metagenómica de próxima generación sea una herramienta potente en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, especialmente cuando otros ensayos más dirigidos, como la PCR , fallan. Sus limitaciones incluyen la utilidad clínica, la validez de laboratorio, el sentido y la sensibilidad, el costo y las consideraciones regulatorias. [1]
Fuera de la medicina clínica , se realizan trabajos similares para identificar material genético en muestras ambientales, como estanques o suelo. [2]
La secuenciación de próxima generación utiliza las técnicas de la metagenómica para identificar y caracterizar el genoma de bacterias , hongos , parásitos y virus sin la necesidad de un conocimiento previo de un patógeno específico directamente a partir de muestras clínicas. [3] La capacidad de detectar todos los patógenos potenciales en una muestra hace que la secuenciación metagenómica de próxima generación sea una herramienta potente en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, especialmente cuando otros ensayos más dirigidos, como la PCR , fallan. [4]
Un flujo de trabajo típico de mNGS consta de los siguientes pasos:
Una forma de detectar estos patógenos es detectar parte de su genoma mediante secuenciación metagenómica ( Next Generation Sequencing -mNGS), que puede ser dirigida o no dirigida. [3]
Debido a esto, la sensibilidad para detectar los microorganismos que se están analizando generalmente aumenta, pero esto conlleva una limitación en la cantidad de patógenos identificables. [3]
El análisis no dirigido es un enfoque de secuenciación metagenómica Shotgun . El ADN y/o ARN completo se secuencia con este enfoque utilizando iniciadores universales . Las lecturas de mNGS resultantes se pueden ensamblar en genomas parciales o completos. Estas secuencias genómicas permiten monitorear brotes hospitalarios para facilitar el control de infecciones y la vigilancia de la salud pública. Además, se pueden usar para subtipificar (identificar una variante genética específica de un microorganismo). [ cita requerida ]
La mNGS no dirigida es el método más prometedor para analizar muestras clínicas y proporcionar un diagnóstico integral de infecciones. Varios grupos han validado la mNGS en las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos (CLIA), como la meningitis o la encefalitis, la sepsis y la neumonía. [3] Este método puede ser muy útil en los entornos en los que no se sospecha una etiología infecciosa exacta. [7] Por ejemplo, en pacientes con sospecha de neumonía, la identificación de la etiología infecciosa subyacente, como en el caso de la COVID-19, tiene importantes implicaciones clínicas y de salud pública. [8] [7]
El método tradicional consiste en formular un diagnóstico diferencial sobre la base de la historia del paciente, la presentación clínica, los hallazgos de imagen y las pruebas de laboratorio. Pero aquí se sugiere una forma diferente de diagnóstico; la secuenciación metagenómica de nueva generación (NGS) es un método prometedor porque se puede identificar un espectro completo de posibles causas (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias) mediante un único ensayo. [3]
A continuación se presentan algunos ejemplos de la aplicación de la secuenciación metagenómica en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. [ cita requerida ]
El método tradicional utilizado para el diagnóstico de enfermedades infecciosas se ha visto cuestionado en algunos casos: enfermedades neuroinflamatorias, falta de pruebas diagnósticas para patógenos raros y la disponibilidad y volumen limitados de muestras del sistema nervioso central (SNC), debido a la necesidad de procedimientos invasivos. Debido a estos problemas, algunos ensayos sugieren una forma diferente de diagnóstico, que es la secuenciación metagenómica de próxima generación (NGS). En resumen, la NGS puede identificar una amplia gama de patógenos en una sola prueba. [9]
Algunos estudios evalúan la utilidad clínica de la NGS metagenómica para el diagnóstico de infecciones neurológicas, en paralelo con las pruebas microbiológicas convencionales. Se ha observado que el mayor rendimiento diagnóstico se obtuvo con una combinación de NGS metagenómica de LCR y pruebas convencionales, incluidas pruebas serológicas y pruebas de tipos de muestras distintos del LCR. [9] A veces, las infecciones neurológicas permanecen sin diagnosticar en una proporción de pacientes a pesar de las pruebas convencionales. [9]
Los resultados de la NGS metagenómica también pueden ser valiosos incluso cuando concuerdan con los resultados de las pruebas convencionales, no solo proporcionando la seguridad de que el diagnóstico obtenido convencionalmente es correcto sino también detectando o descartando potencialmente coinfecciones, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. [9]
En la actualidad, para detectar resistencias de diferentes microbios se utiliza una técnica llamada Sensibilidad a Antibióticos (AST) , pero varios estudios han descubierto que la resistencia bacteriana se encuentra en el genoma y se transmite por vía horizontal (HGT) , por lo que se están desarrollando métodos de secuenciación que faciliten la identificación y caracterización de dichos genomas y metagenomas. Actualmente existen los siguientes métodos para detectar resistencias antimicrobianas: [10]
Los métodos de secuenciación metagenómica han proporcionado mejores resultados que la genómica, debido a que estos presentan menos falsos negativos. Dentro de la secuenciación metagenómica, la metagenómica funcional es un enfoque poderoso para caracterizar los resistomas ; se genera una biblioteca metagenómica clonando el ADN comunitario total extraído de una muestra en un vector de expresión ; esta biblioteca se analiza para determinar la resistencia a los antimicrobianos mediante la siembra en medios selectivos que son letales para el huésped de tipo salvaje. Luego se secuencian los insertos seleccionados de las células huésped resistentes a los antimicrobianos recombinantes supervivientes y las secuencias resultantes se ensamblan y anotan posteriormente (PARFuMS). [10] [11]
La metagenómica funcional ha permitido el descubrimiento de varios mecanismos nuevos de resistencia a los antimicrobianos y sus genes relacionados; un ejemplo de ello es el mecanismo de resistencia a la tetraciclina descubierto recientemente por las destructasas de tetraciclina. [10] Es importante incorporar no solo la secuencia y el mecanismo del gen de resistencia a los antimicrobianos, sino también el contexto genómico, las especies bacterianas hospedadoras y la ubicación geográfica ( metagenoma ). [10]
Se podrían identificar inmediatamente patógenos potencialmente peligrosos, como los virus del Ébola , los coronavirus , etc., y los parientes genéticos más cercanos de los patógenos desconocidos, lo que impulsaría un mayor seguimiento. Se prevé que desempeñará un papel en el futuro de la preparación para pandemias y podría existir como el primer sistema de vigilancia del que dispongamos para detectar brotes de etiología desconocida y responder de manera oportuna. [12]
El uso de mNGS para caracterizar el microbioma ha hecho posible el desarrollo de probióticos bacterianos para ser administrados en forma de píldoras, por ejemplo, como tratamiento de enfermedades asociadas a Clostridioides difficile . [3]
El estudio de la expresión de genes permite caracterizar muchas infecciones, por ejemplo, infecciones por Staphylococcus aureus , enfermedad de Lyme , candidiasis , tuberculosis e influenza . Además, este enfoque puede utilizarse para la clasificación del cáncer . [ cita requerida ]
El análisis de RNAseq tiene muchos otros propósitos y aplicaciones, como identificar interacciones huésped-microbio nuevas o poco apreciadas directamente a partir de muestras clínicas, hacer diagnósticos indirectos en función de una respuesta del huésped humano específica del patógeno y discriminar causas infecciosas versus no infecciosas de enfermedades agudas. [3]
La mayoría de los datos de resultados de metagenómica generados consisten en informes de casos que desmienten el creciente interés en la metagenómica diagnóstica. [13]
En consecuencia, existe una falta general de penetración de este enfoque en el laboratorio de microbiología clínica, ya que realizar un diagnóstico con metagenómica todavía es básicamente útil solo en el contexto del informe de casos, pero no para un verdadero propósito de diagnóstico diario. [13]
A partir de 2018, el modelo de costo-efectividad de la metagenómica en el diagnóstico de la fiebre de origen desconocido concluyó que, incluso después de limitar el costo de la metagenómica diagnóstica a $100 – 1000 por prueba, se requeriría de 2,5 a 4 veces el rendimiento diagnóstico de la tomografía computarizada del abdomen y la pelvis para ser neutral en términos de costos y advirtió contra la "prisa generalizada" para implementar pruebas metagenómicas. [13]
Además, en el caso del descubrimiento de posibles agentes infecciosos nuevos , normalmente solo se publican los resultados positivos, aunque la gran mayoría de los casos secuenciados son negativos, lo que da lugar a una información muy sesgada. Además, la mayor parte del trabajo de descubrimiento basado en la metagenómica que precede al trabajo basado en el diagnóstico incluso menciona los agentes conocidos detectados durante el cribado de casos no resueltos en busca de causas completamente nuevas. [13]
Hasta la fecha, la mayoría de las pruebas publicadas se han realizado de una manera no validada y no declarable. Las "pruebas microbiológicas estándar" a las que se someten las muestras antes de la metagenómica son variables y no han incluido pruebas de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para virus respiratorios comunes o, de manera rutinaria, pruebas de PCR 16S/ITS. [13]
Dados los costos relativos de validar y realizar pruebas metagenómicas en comparación con las de PCR 16S/ITS, la segunda se considera una opción más fácil y eficiente. Una posible excepción a las pruebas 16S/ITS es la sangre, dada la enorme cantidad de secuencias 16S disponibles, lo que hace que los puntos de corte limpios para fines de diagnóstico sean problemáticos. [13]
Además, casi todos los organismos detectados mediante metagenómica para los que existe un tratamiento asociado y, por lo tanto, serían realmente útiles, también son detectables mediante pruebas 16S/ITS (o 16S/ITS-NGS). Esto hace que sea cuestionable la utilidad de la metagenómica en muchos casos de diagnóstico. [13]
Uno de los puntos principales para lograr la validez de laboratorio es la presencia de estándares de referencia y controles al realizar ensayos mNGS, necesarios para asegurar la calidad y estabilidad de esta técnica en el tiempo. [3]
En los laboratorios de microbiología clínica , la cuantificación de la carga microbiana se considera una función de rutina, ya que está asociada con la gravedad y la progresión de la enfermedad. Para lograr una buena cuantificación, se necesita una alta sensibilidad de la técnica. [13]
Mientras que las sustancias interferentes representan un problema común en la química clínica o en los diagnósticos por PCR, el grado de interferencia del huésped (por ejemplo, en biopsias de tejido ) o de los ácidos nucleicos no patógenos (por ejemplo, en las heces) en la metagenómica es un giro nuevo. [3] [13] Además, debido al tamaño relativo del genoma humano en comparación con los genomas microbianos, la interferencia puede ocurrir en niveles bajos de material contaminante. [13]
Otro desafío para la metagenómica clínica en lo que respecta a la sensibilidad es el diagnóstico de coinfecciones donde hay patógenos de alto título que pueden generar resultados sesgados, ya que pueden absorber desproporcionadamente las lecturas y dificultar la distinción de los patógenos menos predominantes. [13]
Además de los problemas con las sustancias que interfieren, especialmente en el área de diagnóstico, la cuantificación y la sensibilidad precisas son esenciales, ya que una confusión en los resultados puede afectar a una tercera persona, el paciente. Por este motivo, los médicos actualmente deben ser muy conscientes de los problemas de intercambio de índices asociados con la secuenciación de Illumina, que pueden dar lugar a la trazabilidad de muestras con códigos de barras incorrectos. [13]
Dado que la metagenómica se ha utilizado generalmente en pacientes en los que todas las demás pruebas realizadas hasta la fecha han dado negativo, las cuestiones relativas a la sensibilidad analítica han sido menos pertinentes. Pero, para descartar causas infecciosas, que es una de las funciones más importantes de la metagenómica clínica, es esencial poder realizar una secuenciación lo suficientemente profunda como para lograr sensibilidades adecuadas. Una forma de hacerlo podría ser el desarrollo de nuevas técnicas de preparación de bibliotecas. [13]
A partir de 2018, el monopolio de Illumina sobre reactivos de secuenciación de última generación de alta calidad ha significado que los reactivos de secuenciación por sí solos cuestan más que los paneles de pruebas sindrómicas aprobados por la FDA . También deben considerarse los costos directos adicionales de la metagenómica, como la extracción, la preparación de la biblioteca y el análisis computacional. [13] En general, la secuenciación metagenómica es más útil y rentable para el descubrimiento de patógenos cuando se cumple al menos uno de los siguientes criterios:
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