La isoforma épsilon de caseína quinasa I o CK1ε es una enzima codificada por el gen CSNK1E en humanos. [5] [6] Es el homólogo mamífero de doubletime . CK1ε es una proteína quinasa de serina/treonina y está muy conservada; por lo tanto, esta quinasa es muy similar a otros miembros de la familia de las caseína quinasas 1 , [7] de las cuales existen siete isoformas de mamíferos (α, β, γ1, γ2, γ3, δ y ε). [8] CK1ε es más similar a CK1δ en estructura y función, ya que las dos enzimas mantienen una alta similitud de secuencia en sus dominios catalíticos y C-terminales reguladores . [8] Este gen es un componente importante del oscilador de los mamíferos que controla los ritmos circadianos celulares . [7] La CK1ε también ha estado implicada en la modulación de diversos problemas de salud humana, como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y la diabetes. [8]
En hámsteres, la mutación CK1ε-tau fue descubierta por primera vez por Michael Menaker y Martin Ralph en 1988 mientras estudiaban un envío de laboratorio de hámsteres sirios . [9] Observaron un hámster con un período circadiano anormal y, después de la reproducción y una caracterización adicional, los dos se dieron cuenta de que la mutación en los hámsteres confería un período de funcionamiento libre más corto de lo normal. [9] Atribuyeron este fenotipo a lo que denominaron la "mutación tau", que fue la primera descripción completa de un mutante circadiano de mamífero. [10] Este descubrimiento proporcionó una herramienta para que otros científicos realizaran investigaciones sobre relojes biológicos y fue un avance importante en este campo. [11]
En 1995, la forma humana de CK1ε fue aislada y clonada por primera vez en el laboratorio Virshup de la Universidad de Utah. [12] [13] Fue identificado oficialmente como una isoforma de la familia de la caseína quinasa 1. [12] [13] Se han encontrado tres variantes de transcripción que codifican la misma proteína para este gen en ratas: CK1ε1, CK1ε2 y CK1ε3; y dos se han encontrado en humanos. [14] [15]
En 2000, el gen CK1ε fue posteriormente mapeado e identificado por Joseph Takahashi y sus colegas, quienes, utilizando un análisis de diferencias representacionales dirigido genéticamente, descubrieron que la mutación tau estaba ubicada en el gen CK1ε. [11] Se descubrió que el gen CK1ε era similar al gen del doble tiempo en Drosophila , [11] que Michael Young y sus colegas caracterizaron e incorporaron por primera vez a la función del reloj biológico en 1998. [16] En humanos, el gen CSNK1E localiza en 22q13.1 y consta de 12 exones . [15]
Alexander Long y sus colegas realizaron imágenes estructurales de CK1ε en 2012 utilizando cristalografía de rayos X. [8] Posteriormente se confirmaron ciertos motivos estructurales relacionados con la quinasa, como un motivo de cadena β que ancla el ATP, un motivo DFG que orienta los fosfatos del ATP, un bucle catalítico que se asemeja al de la PKA y un sustrato principal. Sitios de reconocimiento en el dominio C-terminal. [8]
Las estructuras tridimensionales de los dominios catalíticos de los mamíferos CK1δ y CK1ε se resolvieron por primera vez mediante cristalografía de rayos X en 1996 y 2012, respectivamente. [8] La quinasa CK1 tiene múltiples isoformas, incluido un total de siete isoformas caracterizadas en mamíferos (alfa, beta, gamma1-3, delta y épsilon). [17] Las diferentes isoformas difieren principalmente en la longitud y estructura de su extremo C-terminal. región no catalítica [17] Se ha demostrado que solo las isoformas delta y épsilon desempeñan un papel importante en la regulación del ritmo circadiano.
CK1δ y CK1ε comparten un patrón muy similar en sus estructuras. [17] El bucle P rico en glicina se encuentra entre las cadenas β1 y β2, formando un motivo clásico de cadena β que ancla y sujeta el alfa fosfato de ATP. [8] CK1δ/ε además comparte características conservadas dentro del dominio catalítico , que se componen de un lóbulo N-terminal y un lóbulo C-terminal α-helicoidal. [8] El centro catalítico está ubicado en la región de hendidura entre los dos lóbulos, que también se asocia con el nucleótido y el sustrato. [8] Todos los inhibidores conocidos se unen a este centro, bloqueando la unión de ATP. [17]
La proteína codificada por el gen caseína quinasa 1 épsilon es una proteína quinasa serina/treonina y un miembro de la familia de proteínas caseína quinasa I, cuyos miembros han sido implicados en el control de procesos citoplasmáticos y nucleares , incluida la replicación y reparación del ADN . [15] Al igual que otros miembros de la familia de proteínas caseína quinasa 1, la caseína quinasa 1 épsilon reconoce el motivo Ser (p)XXSer/ Thr para la fosforilación . [18] Se encuentra en el citoplasma como monómero y puede fosforilar una variedad de proteínas, incluido él mismo. [15] Esta autofosforilación ocurre en el dominio C-Terminal de la proteína , una región que se cree que se comporta como un pseudosustrato e inhibe la actividad quinasa. [7] [19] [20]
La proteína caseína quinasa 1 épsilon es parte del oscilador de los mamíferos , un grupo de proteínas que mantienen las células en un horario de aproximadamente 24 horas. [21] Este oscilador, o "reloj circadiano", está formado por un circuito de retroalimentación de transcripción-traducción (TTFL) en el que varias proteínas trabajan en conjunto, cada una regulando la expresión de las demás para generar un ciclo de aproximadamente 24 horas de ambos ARNm. y niveles de proteínas. [22] El TTFL también genera ritmos de producción de aproximadamente 24 horas, como los niveles de liberación de hormonas celulares. [23] Se han observado oscilaciones diarias en la transcripción de proteínas y ARNm en muchas células, incluido el reloj maestro de los mamíferos conocido como núcleo supraquiasmático (SCN). [24] Sin embargo, a diferencia de la mayoría de las proteínas del ritmo circadiano que oscilan en su expresión, la caseína quinasa 1 épsilon es constitutivamente activa. [23]
Las proteínas centrales que componen el TTFL de los mamíferos incluyen Period (PER), Criptocromo (CRY), BMAL1 , CLOCK y caseína quinasa 1 épsilon. [25] BMAL1 y CLOCK funcionan para aumentar la transcripción de PER y CRY formando un heterodímero y uniéndose al dominio E-box aguas arriba de las secuencias codificantes de los genes PER y CRY. [25] Los niveles de PER y CRY están regulados por retroalimentación negativa, lo que significa que reprimen su propia transcripción. [25] La fosforilación de proteínas PER por CK1ε tanto en el citoplasma como en el núcleo marca estas proteínas para su degradación. [26] La fosforilación también dificulta la capacidad de PER para ingresar al núcleo al inducir un cambio conformacional en su secuencia de localización nuclear . [7] [27] [28] Por otro lado, el complejo proteico FBXL3 media la degradación de las proteínas CRY en el citoplasma y el núcleo. [29] [30] Si CRY se une a PER antes de que CK1ε la fosforile, estas tres proteínas se estabilizan en un complejo que puede ingresar al núcleo. [7] Una vez dentro del núcleo, PER y CRY actúan para inhibir su propia transcripción, mientras que la caseína quinasa 1 épsilon actúa para modular la actividad de BMAL1 y CLOCK mediante la fosforilación. [7]
Como se indicó anteriormente, el dominio C-terminal de la caseína quinasa 1 épsilon se comporta como un pseudosustrato cuando se fosforila, inhibiendo la actividad quinasa. [7] [19] [20] También se ha demostrado que el dominio C-terminal está desfosforilado por fosfatasas como la proteína fosfatasa 1 (PP1) in vitro y el cultivo celular, que regula los niveles de caseína quinasa activa in vivo . [7] [22] [31] La teoría actual de los ritmos circadianos plantea la hipótesis de que este ciclo de fosforilación/desfosforilación de la caseína quinasa 1 épsilon es importante en la modulación del período de los ritmos circadianos en la célula, y el aumento de la fosforilación disminuye la actividad de la caseína quinasa 1 épsilon ( y posteriormente aumentando CRY y PER activos) y desfosforilación de la caseína quinasa 1 épsilon, lo que da como resultado una quinasa más activa (y niveles más bajos de CRY y PER activos). [22]
En ratones, se ha demostrado que la caseína quinasa 1 épsilon fosforila tanto PER1 como PER2 , así como CRY1 y CRY2 . [23] La caseína quinasa 1 da como resultado una expresión cíclica de proteínas osciladoras de mamíferos, lo que resulta en un cronometrador (oscilador de mamífero) para la célula: [32]
El fenotipo prominente en los hámsteres mutantes tau CK1ε descubiertos por Menaker era un período de funcionamiento libre inusualmente corto (22 horas en heterocigotos y 20 horas en homocigotos para la mutación), lo que hacía que este alelo fuera semidominante . [34] Posteriormente, Joseph Takahashi y sus colegas mapearon e identificaron el gen CK1ε , lo que reveló una mutación sustitutiva de C a T de un solo par de bases en el gen CK1ε de hámster. [35] Este polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) da como resultado una sustitución de arginina por cisteína en una región del dominio de reconocimiento de fosfato de CK1ε, una región altamente conservada del gen en todos los mamíferos. [35] Actualmente, no está claro cómo exactamente la mutación CK1ε-tau da como resultado un período de funcionamiento libre más corto. [36] Sin embargo, se ha sugerido que la mutación tau es una mutación de ganancia de función, que conduce a una mayor fosforilación de ciertos sitios PER, aumentando así la tasa de degradación de PER y acortando el período circadiano. [37] [21] La mutación CK1ε-tau en hámsteres fue la primera descripción completa de un mutante circadiano de mamífero. [10]
En humanos, las mutaciones que afectan el sitio de fosforilación de PER2 del gen CK1ε y/o CK1δ dan como resultado el síndrome familiar de fase avanzada del sueño (FASPS). [38] [39] Esta mutación, S662G, que resulta en la pérdida de un único sitio aceptor de fosfato en PER2, evita que la proteína CK1ε se una a PER y conduce a un período circadiano inusualmente corto. [33]
Además, se ha identificado una mutación hereditaria en la CK1δ humana, T44A, como otra mutación que causa el acortamiento del período y como otro mecanismo que causa FASPS. [40] Esta mutación reduce la actividad de CK1δ in vivo en humanos y, de manera similar, se ha demostrado que hace lo mismo en ratones. [40] Sin embargo, experimentos en otras especies, como las moscas, han demostrado que esta mutación induce efectos de alargamiento del período. [40]
Además, en humanos, se ha demostrado que las mutaciones P415A y H417R en PER3 desestabilizan la proteína. [41] Se ha demostrado que estas mutaciones generan FASPS y también están asociadas con una regulación alterada del estado de ánimo. [41]
CK1δ/ε tiene compensación de temperatura, una característica de muchos ritmos circadianos. [42] La capacidad de CK1δ/ε para fosforilar sus sustratos permanece constante incluso cuando la temperatura fluctúa, mientras que las velocidades de reacciones normales tienden a aumentar al aumentar la temperatura. [42] Además, los mutantes tau CK1ε muestran una pérdida de compensación de temperatura. [42]
En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) se pueden encontrar dos homólogos funcionales del ritmo circadiano de esta proteína de mamífero . [43] Los homólogos funcionales se refieren a proteínas que comparten una función similar en otro animal pero que no son necesariamente genéticamente similares .
Un gen, que codifica la proteína Doubletime (abreviada dbt ), tiene un propósito similar a la caseína quinasa 1 épsilon en cronobiología , ya que desempeña un papel en la fosforilación de PER . [7] [43] Sin embargo, su secuencia genética no muestra homología de secuencia. [7] [15] [43] [44] Además, la caseína quinasa 1 épsilon no rescata completamente los ritmos circadianos en los knockouts de doble tiempo de la mosca de la fruta ( dbt -/- ), lo que sugiere que estas enzimas cumplen funciones similares, pero no idénticas. [45] [44]
Otro homólogo funcional, el gen de Drosophila para la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3), llamado shaggy y abreviado sgg, codifica una proteína que fosforila a Timeless (TIM), el homólogo funcional CRY de la mosca de la fruta . [46] Al igual que dbt , shaggy no es un homólogo de secuencia de la caseína quinasa 1 épsilon. [46] Por el contrario, Gsk3 también se encuentra en mamíferos y se han implicado mutantes en anomalías del ritmo circadiano en pacientes que padecen trastorno bipolar . [7]
El genoma de Drosophila melanogaster contiene otras enzimas de la familia de la caseína quinasa 1, que se cree que no cumplen ninguna función circadiana. [47] Sin embargo, una enzima diferente de la familia de la caseína quinasa, la caseína quinasa 2 alfa, ha sido implicada en proporcionar la fosforilación inicial de un residuo de serina que es reconocido tanto por DBT como por Shaggy para la fosforilación secuencial de PER y TIM. [48] [49]
Si bien CK1ε se ha considerado tradicionalmente el principal regulador de la fosforilación de PER y CRY, se cree que la isoforma delta de caseína quinasa 1 ( CK1δ o CSNK1D ), una isoforma , desempeña un papel similar en el TTFL. [21] Tanto CK1ε como CK1δ fosforilan y desestabilizan PER in vitro e interactúan con PER y CRY in vivo. [21] Además, se ha demostrado que CK1δ interactúa mejor con las proteínas del reloj molecular de Drosophila que CK1ε, lo que indica que CK1δ puede ser más homólogo de dbt que CK1ε. [21] Además, la espectrometría de masas ha demostrado que la CK1δ es más de 20 veces más abundante que la CK1ε en el hígado. [42]
Se cree que la fosforilación de PER2 está regulada por un mecanismo de interruptor fosfórico. [42] Específicamente, PER2 requiere una fosforilación de cebado inicial para ser fosforilado y posteriormente degradado por CK1δ y/o CK1ε. [42] De esta manera, las fosforilaciones secuenciadas temporalmente de PER2 actúan para retrasar su tasa de degradación y pueden proporcionar información sobre cómo se compensa la temperatura del reloj circadiano. [42] CK1δ y/o CK1ε pueden proporcionar la actividad de cebado. [42] El sitio FASP en PER2 es un objetivo clave de esta actividad de cebado quinasa. [42] Las mutaciones en este sitio pueden afectar la capacidad de PER2 para recibir una fosforilación de cebado, lo que lleva a un alargamiento o acortamiento del período. [42] Otros estudios han sugerido que la fosforilación posterior de PER2 conduce a interacciones estabilizadoras que disminuyen la tasa de degradación de PER. [42] Se cree que esto aumenta el período del reloj circadiano. [42] Se cree que las mutaciones en el área de fosforilación de PER2 están relacionadas con pacientes con FASPS [50]
La vía Wnt canónica implica la acumulación de β-catenina en el citoplasma, que activa los factores de transcripción. [51] La caseína quinasa 1 épsilon y la caseína quinasa 1 delta relacionada se desfosforilan en esta vía. [51] [7] La desfosforilación de la caseína quinasa 1 épsilon probablemente se logra mediante la proteína fosfatasa 2 (PP2A), que aumenta la actividad quinasa de ambas enzimas in vivo. [7] La caseína quinasa 1 épsilon y la caseína quinasa 1 delta han sido implicadas en el aumento de la estabilidad de la β-catenina en el citoplasma, aunque los estudios sobre el mecanismo de esta estabilización no son concluyentes. [52] La teoría actual sobre cómo funcionan la caseína quinasa 1 épsilon y/o la caseína quinasa 1 delta en esta vía es que ambas caseína quinasas estabilizan directamente la β-catenina mediante regulación positiva, o que estabilizan indirectamente la β-catenina mediante regulación negativa de el complejo de degradación de β-catenina ( proteasa ). [7] [53]
Se sabe que la caseína quinasa 1 épsilon y delta fosforilan una proteína supresora de tumores , p53 , in vivo tanto en humanos como en murinos o ratas del viejo mundo. [7] [54] [55] [56] CK1 fosforila p53 en su extremo N para inducir su activación, lo que posteriormente aumenta la detención del ciclo celular y la apoptosis . [57] Se ha demostrado que el daño al ADN activa p53 a través de una activación mejorada de CK1. [57] La inactivación de CK1 conduce a una disminución de la resistencia a la apoptosis. [57]
La caseína quinasa 1 épsilon también está implicada como causante indirecta de cáncer a través de su regulación de la proteína asociada a Sí (YAP), un oncogén y regulador del tamaño de los órganos. [58] Después de cebar mediante fosforilación por la serina/treonina quinasa LATS , se ha demostrado que tanto la caseína quinasa 1 épsilon como la caseína quinasa 1 delta fosforilan YAP y lo marcan para su ubiquitinación y degradación. [59]
Varios estudios han demostrado una conexión entre los componentes moleculares del reloj circadiano y los trastornos psiquiátricos, en particular el abuso de drogas. [60] Los estudios de asociación genética en humanos han implicado a CK1ε/CK1δ en el desarrollo de adicciones a la metanfetamina, la heroína y el alcohol. [60] Además, los estudios en ratones revelan un vínculo entre la actividad CK1ε/CK1δ y el efecto estimulante producido por la metanfetamina. [60] Además, se ha demostrado que la inhibición de CK1ε/CK1δ en roedores disminuye el comportamiento de recaída de alcohol y opiáceos durante la abstinencia. [61] [62]
Se ha demostrado que la caseína quinasa 1 épsilon interactúa con PER1 , [28] PER2 , CRY1 , CRY2 , BMAL1 , CLOCK , NPAS2 y AXIN1 . [7] [63] PER1, PER2 y BMAL1 pueden ser fosforilados directamente por CK1ɛ, mientras que PER3, CRY1 y CRY2 solo pueden ser fosforilados por CK1ɛ cuando están asociados con PER1 o PER2. [21]
Las empresas de biotecnología han producido varios inhibidores para facilitar la investigación sobre la función de la caseína quinasa 1 épsilon. Las pruebas que utilizan inhibidores de CK1ε han confirmado la participación de CK1ε en una variedad de procesos, especialmente en la regulación de los ritmos circadianos.
PF-670462, desarrollado por Pfizer , es un inhibidor bien caracterizado de CK1ε y CK1δ que se ha demostrado que alarga el período de los ritmos circadianos cuando se administra in vitro a fibroblastos de rata y células COS, y a ratones in vivo . [21] [64] [65] PF-4800567 , también desarrollado por Pfizer, es un inhibidor específico de CK1ε. Sin embargo, su capacidad para alargar los ritmos circadianos es más débil que la de PF-670462 tanto en los modelos de fibroblastos de rata in vitro como en los modelos de ratones in vivo . [65] Los mecanismos de inhibición de PF-670462 y PF-4800567 también difieren entre las dos moléculas. [8] PF-670462 mantiene CK1ε/δ con el motivo DFG hacia adentro, mientras que PF-4800567 interactúa hidrofóbicamente con CK1ε/δ para girar el motivo DFG hacia afuera, lo que indica una quinasa tipo II. [8]
IC261 es un inhibidor que se dirige al sitio de unión de ATP tanto de CK1δ como de CK1ε. [21] [66] [57] De manera similar, se ha demostrado que alarga el período circadiano en fibroblastos de rata , [66] y se ha implicado en terapias de tratamiento del cáncer de páncreas y neuroblastómico. [67] [57]
Se ha caracterizado que otros inhibidores de CK1, como D4476 y análogos de pirazolopiridina , que se dirigen a CK1δ, tienen capacidades terapéuticas, pero sus efectos beneficiosos no están bien estudiados y pueden provenir de otros objetivos celulares. [57]
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