Los aptámeros antitrombina son oligonucleótidos portadores de cuádruplex G , que reconocen los exositos de la trombina humana . El primer aptámero antitrombina, TBA, fue generado mediante la tecnología SELEX ( evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial ) en 1992 por LC Bock, JJ Toole y sus colegas. [1] Un segundo aptámero de unión a trombina, HD22, reconoce el exosito II de trombina y fue descubierto en 1997 por NeXstar (ahora Gilead Sciences ). [2] Estos dos aptámeros tienen alta afinidad y buena especificidad y han sido ampliamente estudiados y utilizados para el desarrollo de terapias y diagnósticos basados en aptámeros.
El aptámero TBA (también conocido como G15D, HTQ, HD1, ARC183, GS522, BC-007 o Rovunaptabin) es un ADN monocatenario de 15 unidades con la secuencia 5' - GGTTGGTGTGGGTTGG-3 ' . [1] Interactúa con el exosito I de la alfa-trombina humana, que es el sitio de unión del fibrinógeno , por lo que este aptámero actúa como un agente anticoagulante que inhibe la activación del fibrinógeno y la agregación plaquetaria. Además, TBA muestra buena afinidad y especificidad frente a la trombina. Se ha informado que la constante de disociación de la trombina TBA está en el rango nanomolar y la TBA no interactúa con otras proteínas plasmáticas ni análogos de la trombina (p. ej., trombina gamma). [3] Como resultado, TBA se ha utilizado como un anticoagulante a corto plazo diseñado para su aplicación en la cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria, y su forma optimizada (NU172) se encuentra ahora en la fase II del ensayo clínico realizado por ARCA Biopharma. (NCT00808964). [4] Además, debido a su alta afinidad y especificidad, se combinó una variedad de sensores con TBA y se desarrollaron para el diagnóstico de trombosis.
La estructura terciaria de TBA es un cuádruplex G antiparalelo. Esta estructura en forma de silla se pliega mediante el apilamiento de dos tétradas de guanina (G) , y cuatro guaninas interactúan entre sí a través de enlaces de hidrógeno no similares a los de Watson-Crick (más probablemente enlaces de hidrógeno similares a los de Hoogsteen). En la estructura de TBA, G1, G6, G10 y G15 forman la capa superior de la tétrada G; G2, G5, G11 y G14 forman la segunda capa. Las primeras imágenes cristalográficas con resolución de 2,9 Å (1HUT) se informaron en 1993. Mostró que los bucles T7-G8-T9 y los bucles TT (T3-T4 y T12-T13) conectaban los surcos estrechos y anchos, respectivamente. [5] Sin embargo, dado que se proporcionaron las imágenes cristalográficas de rayos X (4DIH; 4DII) [7] mejoradas de RMN (1HAO) [6 ] , se creó otra topología con el bucle TGT en el lado ancho y los bucles TT en los sitios estrechos. ha sido considerada como una estructura correcta de TBA.
Además de la selectividad por las proteínas, el TBA también muestra preferencia por los iones. Un ion potasio ayuda a que el TBA se pliegue en una estructura cuádruplex G, lo que da como resultado una banda positiva significativa a 295 nm y una banda negativa a 270 nm en su espectro de dicroísmo circular (CD). Además, el ion potasio mejora la estabilidad térmica del TBA. [8] La temperatura de fusión del G-quadruplex de TBA (que mide el cambio de intensidad del pico a 295 nm por CD) en presencia de iones de sodio y potasio es de 24 °C y 53 °C, respectivamente. [7] En comparación con el sodio, el ion potasio encaja perfectamente en la cavidad entre dos planos de la tétrada G y está coordinadamente unido a cuatro átomos de O6 en cada plano. Esto mejora la estabilidad estructural de TBA. Por el contrario, debido a su pequeño tamaño, el ion sodio sólo puede interactuar con cuatro y no con ocho átomos de oxígeno de dos planos de la tétrada G y, en consecuencia, tiene dos posiciones alternativas en la cavidad. La trombina muestra una influencia similar a la del ion potasio. En la condición de deficiencia de iones, la trombina ayuda a que el TBA se forme en una estructura cuádruplex G estable a partir de una bobina aleatoria, lo que resulta en un cambio conformacional. [8] Algunos grupos utilizan esta propiedad para desarrollar sensores de trombina basados en aptámeros. Para ello, el TBA suele montarse con una secuencia adicional con un par FRET ( transferencia de energía por resonancia de Förster ) para formar una estructura dúplex transitoria. Una vez que la parte de TBA interactúa con la trombina, el cambio conformacional cambiaría la distancia entre el par FRET y conduciría a una salida fluorescente. Este enfoque proporciona sensibilidad nanomolar y es capaz de detectar trombina en el suero enriquecido. [9]
En 1996 se informó de un TBA modificado con inversión de polaridad de cadena, conocido como mTBA. Se diseñó una inversión 5'-5' entre T3 y T4 en la secuencia mTBA ( 3′-GGT-5′-5′TGGTGTGGTTGG-3′ ). Esto mejora la estabilidad térmica de la estructura G-quadruplex y aumenta la temperatura de fusión en 4 °C. A pesar de esto, la actividad anticoagulante se ve afectada y reducida por el diseño de inversión. [10]
TBA se une al exosito I de la trombina principalmente a través de sus dos bucles TT (T3, T4 y T12, T13) a través de interacciones polares e hidrofóbicas. Los residuos His71, Arg75, Tyr76, Arg77, Asn78, Ile79, Tyr117 en el epítopo del exosito I están implicados en la interacción con TBA. [7] El exosito 1, al ser un motivo cargado positivamente, participa en estas interacciones con la columna vertebral cargada negativamente de HD1. [11] Es importante destacar que T3 interactúa con His71, que desempeña un papel fundamental para el reconocimiento del fibrinógeno, [12] tanto a través de enlaces de hidrógeno como de interacción hidrofóbica. Sin embargo, en presencia de ion sodio, el enlace de hidrógeno entre T3 y His71 se pierde y la distancia intermolecular es mayor que en el caso del potasio. Esto reduce la afinidad y funcionalidad de TBA. Una situación similar se puede encontrar en el caso de mTBA. No existen interacciones entre mTBA e His71, lo que resulta en la reducción de la actividad anticoagulante. [13] Los resultados de los cálculos in silico con el método de área de superficie de Poisson-Boltzmann (MM-PBSA) de mecánica molecular sugieren que la energía de unión calculada (ΔG) de TBA al exosito I de trombina es ligeramente más fuerte en presencia de K+ (-66,73). kcal.mol-1) que en el caso del Na+ (-60,29kcal.mol-1), sin embargo es probable que ambos estados coexistan. [14]
Se ha demostrado que el TBA puede inhibir la agregación plaquetaria inducida por trombina y la actividad de trombina unida a coágulos. La CI50 de la TBA para la inhibición de la agregación plaquetaria (0,5 U/ml de trombina) es de alrededor de 70 a 80 nmol/L, que es mucho menor que la de la hirudina (~1,7 umol/L). Además, en comparación con la heparina, el TBA es más eficaz en la inhibición de la trombina unida al coágulo. [15] Además, TBA reconoce e inhibe la protrombina con afinidad similar contra la alfa-trombina. Como resultado, TBA prolonga el tiempo de protrombina cuando interactúa con la protrombina. [16] TBA entró en el ensayo clínico de fase I para la cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria realizado por Archemix y Nuvelo (ahora ARCA Biopharma) alrededor de 2005. Aunque mostró una respuesta de inicio rápido con la actividad anticoagulante deseada, la actividad requiere una dosis significativamente alta de TBA. [17] Así, las empresas rediseñaron la secuencia de TBA y desarrollaron un aptámero de ADN de 26 unidades de segunda generación conocido como NU172, que ahora se encuentra en la fase II del ensayo clínico. [4]
El aptámero HD22 (también conocido como HTDQ) es un aptámero optimizado con 29 ( 5' - AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3 ' ) o 27 (sin el primer y el último nucleótido de la forma de 29 meros). [2] [18] Este aptámero reconoce el exosito II de la trombina, que participa en la activación del factor V y del factor VIII y media en la unión de la heparina . Por tanto, HD22 inhibe las activaciones de los factores V/VIII en lugar de la del fibrinógeno. A pesar de que este aptámero solo muestra un efecto moderado sobre la regulación del fibrinógeno, la afinidad de este aptámero es ligeramente mayor que la del TBA (KD ~ 0,5 nM) y hoy en día este aptámero se usa ampliamente para el desarrollo de sensores de aptámero.
A diferencia de TBA, HD22 tiene una estructura mixta dúplex/G-quadruplex. Recientemente (4I7Y) se informó la imagen cristalográfica de rayos X de HD22 (forma 27mer) con una resolución de 2,4 Å. Los nucleótidos 1-3 y 25-27 con un C4-G23 adicional forman un motivo dúplex, y la secuencia que va de G5 a G20 se pliega en una estructura G-cuadruplex con cuatro bucles de conexión: T9-A10, T18-T19, G13- C14-A15 y un bucle de un nucleótido (T6). En el núcleo del motivo G-quadruplex, dos planos G-tétrada están formados por G5-G7-G12-G16 y G8-G11-G17-G20. El plano superior (G5-G7-G12-G16) no es una tétrada G típica con la topología de cadena de alternancia anti - syn - anti - syn . En cambio, tres guaninas (G5, G7 y G16) adoptan una conformación sincronizada , y solo una guanina (G12) adopta una conformación anti . Además, el bucle de un nucleótido se inserta entre G5 y G7. Esto hace que la tétrada G no se forme a través de un patrón típicamente cíclico. Este inusual plan de tétrada G está formado por cuatro enlaces de hidrógeno: uno en N2:N7(G5-G16), dos en O6:N7(G12-G7; G16-G12) y uno en O6:N2 (G7-G5). Se podrían encontrar algunas otras interacciones en el motivo G-quadruplex: dos pares de bases de Watson-Crick (T6-A15 y A10-T19) y una G-fork (G5-G21). Es importante destacar que, debido a la interacción entre G5 y G21, hay un giro de 90 grados entre los motivos G-qudruplex y dúplex. [19]
Los nucleótidos G23, T24, G25, A26, C27 en el dúplex y T9, T18, T19, G20 en el cuádruplex G contribuyen a la interacción con el exosito II de la trombina. En el lado de las proteínas, en la interacción participan los residuos Tyr89, His91, Pro92, Arg93, Tyr94, Asn95, Trp96, Arg97, Arg126, Leu130, Arg165, Lys169, His230, Arg233, Trp237, Val241 y Phe245 en la trombina. Dado que el exosito II es un motivo cargado positivamente, crea muchos pares de iones con la columna vertebral HD22, especialmente en la región dúplex. Las interacciones hidrofóbicas se observan principalmente en la región G-quadruplex (T9, T18 y T10), y esto estabiliza la formación del complejo. Además, la interacción con la trombina mejora la estabilidad térmica de la estructura HD22 y da como resultado un aumento de la temperatura de fusión (de 36 a 48 °C). [19] La energía de unión calculada de HD22 al exosito II de trombina es -88,37 -kcal.mol-1. [14]
Al igual que los anticuerpos, los aptámeros TBA y HD22 muestran un efecto de avidez contra la trombina después de la dimerización. Cuando TBA y HD22 se conjugan con un conector óptimo [20] [21] o se coimprimen en la superficie del sensor con una densidad óptima, [22] la afinidad contra la trombina podría mejorar significativamente entre 100 y 10 000 veces. Además, la dimerización también mejora la actividad anticoagulante. La construcción TBA-HD22 (unida con poliA de 16 unidades) muestra una mejora significativa tanto en el ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada como en el tiempo de coagulación y la agregación plaquetaria inducida por trombina. El constructo TBA-HD22 muestra una eficacia comparable a la bivalirudina , pero mucho más potente que el argatroban . Además, la avidez de TBA-HD22 se puede examinar mediante el tiempo de coagulación de ecarina . Ecarin activa la protrombina y, en consecuencia, produce meizotrombina. El exosito II no es accesible en la meizotrombina, por lo que la parte HD22 no puede interactuar directamente con la meizotrombina. Como resultado, la construcción TBA-HD22 no puede mejorar el tiempo de coagulación de ecarina, lo que demuestra aún más que la mejora de la funcionalidad del aptámero se debe a la avidez de TBA-HD22. [23]