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Proteasa TEV

La proteasa TEV ( EC 3.4.22.44, endopeptidasa de inclusión nuclear a del virus del grabado del tabaco ) es una cisteína proteasa altamente específica de secuencia del virus del grabado del tabaco (TEV). [1] Es un miembro del clan PA de proteasas similares a la quimotripsina . [2] Debido a su alta especificidad de secuencia, la proteasa TEV se utiliza con frecuencia para la escisión controlada de proteínas de fusión in vitro e in vivo . [3] La secuencia de consenso reconocida por la proteasa TEV es Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-|-Ser, donde "|" denota enlace peptídico escindido . [4]

Origen

El virus del grabado del tabaco codifica todo su genoma como una única poliproteína masiva (350 kDa). Esta se divide en unidades funcionales mediante tres proteasas: la proteasa P1 (1 sitio de división), la proteasa del componente auxiliar (1 sitio de división) y la proteasa TEV (7 sitios de división). [1] La proteasa TEV nativa también contiene un sitio de división interna. Este sitio se divide lentamente para inactivar la enzima (se desconoce la razón fisiológica de esto).

Estructura y función

Estructura de la proteasa TEV. Los dobles barriles β que definen la superfamilia están resaltados en rojo. ( PDB : 1lvm ​)

La estructura de la proteasa TEV se ha resuelto mediante cristalografía de rayos X. [5] Está compuesta por dos barriles β y una cola C-terminal flexible y muestra homología estructural con la superfamilia de proteasas de quimotripsina ( clan PA , familia C4 según la clasificación MEROPS ). [2] Aunque es homóloga a las serina proteasas celulares (como la tripsina , la elastasa , la trombina , etc.), la proteasa TEV utiliza una cisteína como su nucleófilo catalítico [6] (al igual que muchas otras proteasas virales).

La catálisis covalente se realiza con una tríada Asp-His-Cys , dividida entre los dos barriles (Asp en β1 y His y Cys en β2). [7] El sustrato se mantiene como una lámina β, formando una interacción antiparalela con la hendidura entre los barriles y una interacción paralela con la cola C-terminal. [8] Por lo tanto, la enzima forma un túnel de unión alrededor del sustrato y las interacciones de la cadena lateral controlan la especificidad. [5]

Especificidad

Modelo de superficie de TEV unido a sustrato no escindido (negro), que también muestra la tríada catalítica (rojo). El sustrato se une dentro de un túnel de sitio activo (izquierda). Un corte transversal (derecha) muestra la forma complementaria del túnel de unión al sustrato. ( PDB : 1lvb ​)

La secuencia de escisión nativa preferida se identificó por primera vez examinando los sitios de corte en el sustrato de poliproteína nativo en busca de una secuencia recurrente. El consenso para estos sitios de corte nativos es ENLYFQ\S donde '\' denota el enlace peptídico escindido . [4] Los residuos del sustrato están etiquetados como P6 a P1 antes del sitio de corte y P1' después del sitio de corte. Los primeros trabajos también midieron la escisión de una serie de sustratos similares para caracterizar cuán específica era la proteasa para la secuencia nativa. [9] [10]

Estudios posteriores han utilizado la secuenciación de sustratos escindidos de un grupo de secuencias aleatorias para determinar patrones de preferencia. [11] [12] Aunque ENLYFQ\S es la secuencia óptima, la proteasa es activa en mayor o menor medida en una variedad de sustratos (es decir, muestra cierta promiscuidad de sustrato ). La escisión más alta es de secuencias más cercanas al consenso EXLYΦQ\φ donde X es cualquier residuo, Φ es cualquier hidrófobo grande o mediano y φ es cualquier residuo hidrófobo o polar pequeño. Aunque esta secuencia es la óptima, las secuencias con residuos desfavorecidos en algunas posiciones aún pueden escindirse si el resto de la secuencia es óptima. [10] [12]

La especificidad está dada por la gran área de contacto entre la enzima y el sustrato. Las proteasas como la tripsina tienen especificidad para un residuo antes y después del enlace escindido debido a una hendidura de unión poco profunda con solo uno o dos bolsillos que unen las cadenas laterales del sustrato. Por el contrario, las proteasas virales como la proteasa TEV tienen una cola C-terminal larga que cubre completamente el sustrato para crear un túnel de unión. Este túnel contiene un conjunto de bolsillos de unión ajustados de modo que cada cadena lateral del péptido del sustrato (P6 a P1') está unida en un sitio complementario (S6 a S1'). [5]

En particular, la cadena lateral del péptido P6-Glu contacta una red de tres enlaces de hidrógeno; P5-Asn apunta al solvente, sin generar interacciones específicas (de ahí la ausencia de consenso del sustrato en esta posición); P4-Leu está enterrado en un bolsillo hidrofóbico; P3-Tyr se mantiene en un bolsillo hidrofóbico con un enlace de hidrógeno corto en el extremo; P2-Phe también está rodeado de hidrófobos, incluida la cara de la tríada histidina; P1-Gln forma cuatro enlaces de hidrógeno; y P1'-Ser está solo parcialmente encerrado en un surco hidrofóbico poco profundo. [5]

Aplicación como herramienta bioquímica

Uno de los principales usos de esta proteína es la eliminación de etiquetas de afinidad de proteínas de fusión recombinantes purificadas . La razón para el uso de la proteasa TEV como herramienta bioquímica es su alta especificidad de secuencia. Esta especificidad permite la escisión controlada de proteínas cuando la secuencia de preferencia se inserta en bucles flexibles. También hace que la proteasa TEV sea relativamente no tóxica in vivo , ya que la secuencia reconocida rara vez se encuentra en las proteínas. [13]

Aunque el diseño racional ha tenido un éxito limitado en el cambio de la especificidad de la proteasa, se ha utilizado la evolución dirigida para cambiar el residuo preferido antes [14] o después [15] [16] del sitio de escisión.

Sin embargo, la proteasa TEV tiene limitaciones como herramienta bioquímica. Es propensa a la desactivación por autoescisión (autolisis), aunque esto puede eliminarse mediante una única mutación S219V en el sitio de escisión interno. [17] La ​​proteasa expresada sola también es poco soluble, sin embargo, se han realizado varios intentos para mejorar su solubilidad mediante evolución dirigida y diseño computacional. También se ha demostrado que la expresión puede mejorarse mediante la fusión con la proteína de unión a maltosa (MBP), que actúa como un socio que mejora la solubilidad. [3]

Se ha informado que la proteasa TEV muestra una pérdida de actividad de 10 veces a 4 °C. [18] La proteasa TEV muestra pérdida de actividad a temperaturas superiores a 34 °C. [19] La proteasa TEV original requería la presencia de un agente reductor para una alta actividad, lo que podría interferir con la función de las proteínas que contienen enlaces disulfuro. Después de la incorporación de varias mutaciones, las versiones posteriores de la "proteasa superTEV" son altamente activas en presencia o ausencia de agente reductor. [20] [21] [22]

El peso molecular de esta enzima varía entre 25 y 27 kDa dependiendo de la construcción específica utilizada.

Referencias

  1. ^ ab UniProt: Poliproteína TEV: "P04517".
  2. ^ ab Rawlings ND, Barrett AJ, Bateman A (enero de 2012). "MEROPS: la base de datos de enzimas proteolíticas, sus sustratos e inhibidores". Nucleic Acids Res . 40 (número de la base de datos): D343–50. doi :10.1093/nar/gkr987. PMC 3245014 . PMID  22086950. 
  3. ^ ab Kapust RB, Waugh DS (julio de 2000). "Procesamiento intracelular controlado de proteínas de fusión por proteasa TEV". Protein Expr. Purif . 19 (2): 312–8. doi :10.1006/prep.2000.1251. PMID  10873547.
  4. ^ ab Carrington JC, Dougherty WG (mayo de 1988). "Un casete de sitio de escisión viral: identificación de secuencias de aminoácidos requeridas para el procesamiento de poliproteínas del virus del grabado del tabaco". Proc. Natl. Sci. USA . 85 (10): 3391–5. Bibcode :1988PNAS...85.3391C. doi : 10.1073/pnas.85.10.3391 . PMC 280215 . PMID  3285343. 
  5. ^ abcd Phan J, Zdanov A, Evdokimov AG, Tropea JE, Peters HK, Kapust RB, Li M, Wlodawer A, Waugh DS (diciembre de 2002). "Base estructural de la especificidad del sustrato de la proteasa del virus del grabado del tabaco". J. Biol. Chem . 277 (52): 50564–72. doi : 10.1074/jbc.M207224200 . PMID  12377789.
  6. ^ Bazan JF, Fletterick RJ (noviembre de 1988). "Las proteasas de cisteína virales son homólogas a la familia de proteasas de serina similares a la tripsina: implicaciones estructurales y funcionales". Proc. Natl. Sci. USA . 85 (21): 7872–6. Bibcode :1988PNAS...85.7872B. doi : 10.1073/pnas.85.21.7872 . PMC 282299 . PMID  3186696. 
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