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Sistema libre de células

Un sistema libre de células es una herramienta in vitro ampliamente utilizada para estudiar reacciones biológicas que ocurren dentro de las células aparte de un sistema celular completo, reduciendo así las interacciones complejas que normalmente se encuentran cuando se trabaja en una célula completa. [1] Las fracciones subcelulares se pueden aislar mediante ultracentrifugación para proporcionar maquinaria molecular que se puede utilizar en reacciones en ausencia de muchos de los otros componentes celulares. [2] Se han utilizado componentes internos de células eucariotas y procarióticas para la creación de estos entornos simplificados. [3] [4] Estos sistemas han permitido que surja la biología sintética sin células , proporcionando control sobre qué reacción se examina, así como su rendimiento, y reduciendo las consideraciones que de otro modo se invocarían cuando se trabaja con células vivas más sensibles. [5]

Tipos

Los sistemas libres de células se pueden dividir en dos clasificaciones principales: basados ​​en extractos celulares, que eliminan componentes del interior de una célula completa para uso externo, y basados ​​en enzimas purificadas, que utilizan componentes purificados de las moléculas que se sabe que están involucradas en un proceso determinado. . [6] [7] El tipo basado en extractos celulares es susceptible a problemas como la rápida degradación de componentes fuera de su huésped, como se muestra en un estudio de Kitaoka et al. donde un sistema de traducción libre de células basado en Escherichia coli ( E. coli ), del tipo basado en extractos celulares, hizo que la plantilla de ARNm se degradara muy rápidamente y provocó la parada de la síntesis de proteínas . [8]

Preparación

Los métodos de preparación varían entre situaciones de ambos tipos de sistemas libres de células.

A base de extracto celular

Podría decirse que el premio Nobel Eduard Buchner fue el primero en presentar un sistema sin células utilizando extractos de levadura , pero desde entonces se han encontrado fuentes alternativas. [9] [10] E. coli , germen de trigo y reticulocitos de conejo han demostrado ser útiles para crear sistemas libres de células mediante la extracción de sus componentes internos. [3] [11] Los extractos de E. coli 30S se han obtenido, por ejemplo, moliendo las bacterias con alúmina , seguido de una limpieza adicional. [12] De manera similar, el germen de trigo se ha molido con arena lavada con ácido o vidrio en polvo para abrir las membranas celulares . [13] [14] Se lisaron reticulocitos de conejo en una solución de MgCl 2 y se filtró el extracto de las membranas mediante centrifugación. [15]

Usos

Los biosistemas de biotransformación de vías sintéticas libres de células se proponen como una nueva plataforma de biofabricación de bajo costo en comparación con la fermentación microbiana utilizada durante miles de años. [3] [16] Los biosistemas libres de células tienen varias ventajas adecuadas en aplicaciones industriales: [6]

C 6 H 10 O 5 (l) + 7 H 2 O (l) → 12 H 2 (g) + 6 CO 2 (g),
Se han producido casi 12 H 2 por unidad de glucosa de polisacáridos y agua , tres veces el rendimiento teórico de los mejores microorganismos anaeróbicos productores de hidrógeno . [17]

Síntesis de proteínas

Los biosistemas in vitro se pueden controlar y acceder fácilmente sin membranas. [16] En particular, en el trabajo que condujo a un premio Nobel, el experimento de Nirenberg y Matthaei utilizó un sistema libre de células, del tipo basado en extracto celular, para incorporar aminoácidos seleccionados marcados radiactivamente en proteínas sintetizadas con 30S extraídas de E. coli . [12] [21] Estudios más recientes, como el estudio realizado por Spirin et al. con versiones procariotas y eucariotas de su sistema de traducción libre de células, también han sintetizado proteínas con mayor producción, incorporando técnicas como el flujo continuo para añadir materiales y eliminar productos. [22] Con tales avances en el rendimiento, las aplicaciones de productividad se han ampliado, como la síntesis de proteínas de fusión para servir potencialmente como vacunas para los linfomas de células B. [23] Además, la síntesis de proteínas libres de células se está convirtiendo en una nueva opción alternativa para la síntesis rápida de proteínas. [6]

Manipulación metabólica

La ingeniería de procesos metabólicos se ha logrado mediante sistemas libres de células. [24] [10] [3] Bujara et al. , por ejemplo, pudieron utilizar extractos de redes glicolíticas , que consisten en enzimas de E. coli que producen fosfato de dihidroxiacetona , para analizar en tiempo real las concentraciones de metabolitos mientras alteran los niveles de enzimas, con el resultado final de una producción óptima de fosfato de dihidroxiacetona . [25] Además, Calhoun y Swartz pudieron utilizar un intermedio glicolítico para alimentar un sistema libre de células, lo que permitió una generación de ATP relativamente económica en comparación con el uso de reactivos en reacciones de fosfoenolpiruvato . [26]

Incorporación de aminoácidos no naturales.

También se han utilizado sistemas libres de células para incorporar aminoácidos no naturales . [26] [27] Shimizu et al. Pudieron cambiar un codón de parada a un codón sentido omitiendo el factor de liberación RF1 , lo que indica la capacidad de insertar los aminoácidos deseados en situaciones no naturales. Esto es útil en sistemas donde trabajar dentro de una célula es problemático, como el proceso de metabolismo de los aminoácidos que impide el etiquetado específico de aminoácidos que sería útil en la espectroscopia de RMN multidimensional . [28] Kigawa y otros. Pudieron marcar con éxito aminoácidos en un sistema libre de células donde el metabolismo de los aminoácidos ya no estaba presente, lo que hizo que dichos sistemas fueran útiles para los estudios de RMN. [28]

Referencias

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