Elemento de respuesta del ADN en algunos eucariotas
Una E-box (enhancer box) es un elemento de respuesta del ADN que se encuentra en algunos eucariotas y que actúa como un sitio de unión a proteínas y se ha descubierto que regula la expresión génica en neuronas , músculos y otros tejidos. [1] Su secuencia de ADN específica, CANNTG (donde N puede ser cualquier nucleótido ), con una secuencia canónica palindrómica de CACGTG, [2] es reconocida y unida por factores de transcripción para iniciar la transcripción génica . Una vez que los factores de transcripción se unen a los promotores a través de la E-box, otras enzimas pueden unirse al promotor y facilitar la transcripción de ADN a ARNm .
Descubrimiento
La E-box fue descubierta en una colaboración entre los laboratorios de Susumu Tonegawa y Walter Gilbert en 1985 como un elemento de control en el potenciador de la cadena pesada de inmunoglobulina . [3] [4] Encontraron que una región de 140 pares de bases en el elemento potenciador de la transcripción específico de tejido era suficiente para diferentes niveles de mejora de la transcripción en diferentes tejidos y secuencias. Sugirieron que las proteínas producidas por tejidos específicos actuaban sobre estos potenciadores para activar conjuntos de genes durante la diferenciación celular.
En 1989, el laboratorio de David Baltimore descubrió las dos primeras proteínas de unión a la caja E , E12 y E47. [5] Estos potenciadores de inmunoglobulina podían unirse como heterodímeros a las proteínas a través de los dominios bHLH . En 1990, se descubrió otra proteína E, ITF-2A (posteriormente rebautizada como E2-2Alt), que puede unirse a los potenciadores de la cadena ligera de inmunoglobulina . [6] Dos años más tarde, se descubrió la tercera proteína de unión a la caja E, HEB, mediante el análisis de una biblioteca de ADNc de células HeLa . [7] En 1997 se descubrió una variante de empalme de la E2-2 y se descubrió que inhibe el promotor de un gen específico del músculo. [8]
Desde entonces, los investigadores han establecido que la E-box afecta la transcripción genética en varios eucariotas y han encontrado factores de unión a la E-box que identifican secuencias de consenso de la E-box . [9] En particular, varios experimentos han demostrado que la E-box es una parte integral del ciclo de retroalimentación de transcripción-traducción que comprende el reloj circadiano .
Vinculante
Las proteínas de unión a la caja E desempeñan un papel importante en la regulación de la actividad transcripcional. Estas proteínas suelen contener el motivo estructural proteico básico hélice-bucle-hélice , que les permite unirse como dímeros . [10] Este motivo consta de dos hélices α anfipáticas , separadas por una pequeña secuencia de aminoácidos , que forman uno o más giros β. Las interacciones hidrofóbicas entre estas hélices α estabilizan la dimerización. Además, cada monómero bHLH tiene una región básica, que ayuda a mediar el reconocimiento entre el monómero bHLH y la caja E (la región básica interactúa con el surco mayor del ADN ). Dependiendo del motivo del ADN ("CAGCTG" frente a "CACGTG"), la proteína bHLH tiene un conjunto diferente de residuos básicos.
Posición relativa de CTRR y E-Box
La unión de la caja E está modulada por Zn 2+ en ratones. Las regiones ricas en CT (CTRR) ubicadas aproximadamente 23 nucleótidos antes de la caja E son importantes en la unión de la caja E, la transactivación (mayor tasa de expresión genética) y la transcripción de los genes circadianos BMAL1 / NPAS2 y los complejos BMAL1/ CLOCK . [11]
Se ha descubierto que la especificidad de unión de las diferentes cajas E es esencial para su función. Las cajas E con diferentes funciones tienen una cantidad y un tipo diferentes de factor de unión. [12]
La secuencia de consenso de la E-box suele ser CANNTG; sin embargo, existen otras E-boxes de secuencias similares llamadas E-boxes no canónicas. Estas incluyen, entre otras:
La secuencia CACGTT se encuentra 20 pb aguas arriba del gen PER2 (Period2 ) del ratón y regula su expresión [13]
Secuencia CAGCTT encontrada dentro del potenciador central MyoD [14]
El vínculo entre los genes regulados por E-box y el reloj circadiano se descubrió en 1997, cuando Hao, Allen y Hardin (Departamento de Biología de la Universidad Texas A&M ) analizaron la ritmicidad en el gen del período ( per ) en Drosophila melanogaster . [16] Encontraron un potenciador transcripcional circadiano aguas arriba del gen per dentro de un fragmento de ADN de 69 pb. Dependiendo de los niveles de proteína PER, el potenciador impulsó altos niveles de transcripción de ARNm tanto en condiciones LD (luz-oscuridad) como DD (oscuridad constante). Se descubrió que el potenciador era necesario para la expresión génica de alto nivel , pero no para la ritmicidad circadiana. También funciona de forma independiente como objetivo del complejo BMAL1/CLOCK.
La E-box juega un papel importante en los genes circadianos; hasta ahora, se han identificado nueve genes circadianos controlados por E/E'BOX: PER1 , PER2, BHLHB2 , BHLHB3 , CRY1 , DBP , Nr1d1 , Nr1d2 y RORC. [17] Como la E-box está conectada a varios genes circadianos, es posible que los genes y proteínas asociados con ella sean "puntos cruciales y vulnerables en el sistema (circadiano)". [18]
Los elementos relacionados con CLOCK similares a E-box (EL-box; GGCACGAGGC) también son importantes para mantener el ritmo circadiano en los genes controlados por el reloj. De manera similar a E-box, el elemento relacionado con CLOCK similar a E-box también puede inducir la transcripción de BMAL1/CLOCK, que luego puede conducir a la expresión en otros genes que contienen EL-box (Ank, DBP, Nr1d1). [20] Sin embargo, existen diferencias entre EL-box y E-box normal. La supresión de DEC1 y DEC2 tiene un efecto más fuerte en E-box que en EL-box. Además, HES1, que puede unirse a una secuencia de consenso diferente (CACNAG, conocida como N-box), muestra un efecto de supresión en EL-box, pero no en E-box.
Tanto las secuencias E-box no canónicas como las secuencias similares a E-box son cruciales para la oscilación circadiana. Investigaciones recientes sobre este tema plantean la hipótesis de que una secuencia E-box canónica o no canónica seguida de una secuencia similar a E-box con un intervalo de 6 pares de bases entre ellas es una combinación necesaria para la transcripción circadiana. [21] El análisis in silico también sugiere que dicho intervalo existía en otros genes conocidos controlados por el reloj.
Función de las proteínas que se unen a las cajas E
Hay varias proteínas que se unen a la caja E y afectan la transcripción genética.
Complejo CLOCK-ARNTL
El complejo CLOCK- ARNTL (BMAL1) es una parte integral del ciclo circadiano de los mamíferos y es vital para mantener la ritmicidad circadiana.
Sabiendo que la unión activa la transcripción del gen per en la región promotora, los investigadores descubrieron en 2002 que DEC1 y DEC2 (factores de transcripción bHLH) reprimían el complejo CLOCK-BMAL1 a través de la interacción directa con BMAL1 y/o la competencia por elementos E-box. Llegaron a la conclusión de que DEC1 y DEC2 eran reguladores del reloj molecular de los mamíferos. [22]
En 2006, Ripperger y Schibler descubrieron que la unión de este complejo a la E-box impulsaba la transcripción circadiana de DBP y las transiciones de la cromatina (un cambio de cromatina a heterocromatina facultativa ). [23] Se concluyó que CLOCK regula la expresión de DBP al unirse a motivos E-box en regiones potenciadoras ubicadas en el primer y segundo intrones .
MYC (c-Myc, unoncogén)
MYC ( c-Myc ), un gen que codifica un factor de transcripción Myc , es importante en la regulación de la proliferación y la apoptosis de células de mamíferos .
En 1991, los investigadores probaron si c-Myc podía unirse al ADN dimerizando su expresión a E12. Los dímeros de E6, la proteína quimérica , pudieron unirse a un elemento E-box (GGCCACGTGACC) que fue reconocido por otras proteínas HLH. [24] La expresión de E6 suprimió la función de c-Myc, lo que demostró un vínculo entre ambos.
En 1996, se descubrió que Myc heterodimeriza con MAX y que este complejo heterodimérico podría unirse a la secuencia E-box CAC(G/A)TG y activar la transcripción. [25]
En 1998, se concluyó que la función de c-Myc depende de la activación de la transcripción de genes particulares a través de elementos E-box. [26]
MioD1(MioD)
MyoD proviene de la familia Mrf bHLH y su función principal es la miogénesis , la formación de tejido muscular. [9] Otros miembros de esta familia incluyen miogenina , Myf5 , Myf6 , Mist1 y Nex-1.
Cuando MyoD se une al motivo E-box CANNTG, se inicia la diferenciación muscular y la expresión de proteínas específicas del músculo. [27] Los investigadores eliminaron varias partes de la secuencia recombinante de MyoD y concluyeron que MyoD usaba elementos abarcadores para unirse a la E-box y a la estructura tetraplex de la secuencia promotora del gen específico del músculo α7 integrina y sMtCK sarcomérica .
La E47 se produce por el empalme alternativo de E2A en exones específicos de bHLH que codifican E47 . Su función es regular la expresión y diferenciación de genes específicos de tejidos. Muchas quinasas se han asociado con E47, incluidas 3pk y MK2. Estas 2 proteínas forman un complejo con E47 y reducen su actividad de transcripción. [32] También se ha demostrado que CKII y PKA fosforilan E47 in vitro. [33] [34] [35]
De manera similar a otras proteínas de unión a la caja E, la E47 también se une a la secuencia CANNTG en la caja E. En ratones homocigotos knock out para E2A, el desarrollo de las células B se detiene antes de la etapa de disposición DJ y las células B no maduran. [36] Se ha demostrado que la E47 se une como heterodímero (con E12) [37] o como homodímero (pero más débil). [38]
Investigaciones recientes
Aunque se desconoce la base estructural de cómo BMAL1/CLOCK interactúa con la E-box, investigaciones recientes han demostrado que los dominios proteicos bHLH de BMAL1/CLOCK son muy similares a otras proteínas que contienen bHLH, por ejemplo, Myc/Max, que se han cristalizado con E-boxes. [39] Se supone que se necesitan bases específicas para soportar esta unión de alta afinidad. Además, las restricciones de secuencia en la región alrededor de la E-box circadiana no se comprenden por completo: se cree que es necesario, pero no suficiente, que las E-boxes estén espaciadas aleatoriamente entre sí en la secuencia genética para que se produzca la transcripción circadiana. Las investigaciones recientes que involucran a la E-box se han dirigido a tratar de encontrar más proteínas de unión, así como a descubrir más mecanismos para inhibir la unión.
Los investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing descubrieron que la amplitud de FBXL3 (proteína F-box/rica en repeticiones de leucina) se expresa a través de una E-box. [40] Estudiaron ratones con deficiencia de FBXL3 y descubrieron que regula los bucles de retroalimentación en los ritmos circadianos al afectar la duración del período circadiano.
Un estudio publicado el 4 de abril de 2013 por investigadores de la Facultad de Medicina de Harvard descubrió que los nucleótidos a ambos lados de una caja E influyen en qué factores de transcripción pueden unirse a la propia caja E. [41] Estos nucleótidos determinan la disposición espacial tridimensional de la cadena de ADN y restringen el tamaño de los factores de transcripción que se unen . El estudio también encontró diferencias en los patrones de unión entre las cadenas in vivo e in vitro .
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