Una prueba de ácido nucleico ( NAT ) es una técnica utilizada para detectar una secuencia de ácido nucleico particular y, por lo tanto, generalmente para detectar e identificar una especie o subespecie particular de organismo, a menudo un virus o bacteria que actúa como patógeno en la sangre , los tejidos , la orina , etc. Las NAT se diferencian de otras pruebas en que detectan materiales genéticos ( ARN o ADN ) en lugar de antígenos o anticuerpos . La detección de material genético permite un diagnóstico temprano de una enfermedad porque la detección de antígenos y/o anticuerpos requiere tiempo para que comiencen a aparecer en el torrente sanguíneo. [1] Dado que la cantidad de un determinado material genético suele ser muy pequeña, muchas NAT incluyen un paso que amplifica el material genético, es decir, hace muchas copias del mismo. Estas NAT se denominan pruebas de amplificación de ácidos nucleicos ( NAAT ). Hay varias formas de amplificación, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el ensayo de desplazamiento de cadena (SDA) o el ensayo mediado por la transcripción (TMA). [2]
Prácticamente todos los métodos de amplificación de ácidos nucleicos y tecnologías de detección utilizan la especificidad del emparejamiento de bases Watson-Crick ; Las moléculas cebadoras o sondas monocatenarias capturan moléculas diana de ADN o ARN de hebras complementarias . Por lo tanto, el diseño de las cadenas de sonda es muy importante para aumentar la sensibilidad y especificidad de la detección. Sin embargo, los mutantes que forman la base genética de diversas enfermedades humanas suelen ser ligeramente diferentes de los ácidos nucleicos normales. A menudo, sólo se diferencian en una única base, por ejemplo, inserciones , deleciones y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). En este caso, puede producirse fácilmente una unión imperfecta entre la sonda y el objetivo, lo que da lugar a resultados falsos positivos , como confundir una cepa comensal con una patógena. Se han dedicado muchas investigaciones a lograr la especificidad de una sola base.
Las hebras de ácido nucleico (ADN y ARN) con sus secuencias correspondientes se unen en cadenas de pares y se cierran como velcro en una secadora de ropa. Pero cada nodo de la cadena no es muy pegajoso, por lo que la cadena bicatenaria continuamente se abre parcialmente y se vuelve a cerrar bajo la influencia de las vibraciones ambientales (lo que se conoce como ruido térmico o movimiento browniano ). Las parejas más largas son más estables. Las pruebas de ácido nucleico utilizan una "sonda" que es una hebra larga con una hebra corta adherida a ella. La larga cadena del cebador tiene una secuencia correspondiente (complementaria) a una cadena "objetivo" del organismo patógeno que se está detectando. La cadena de la enfermedad se adhiere firmemente a la parte expuesta de la cadena larga del cebador (llamada "punto de apoyo") y luego, poco a poco, desplaza la cadena corta "protectora" de la sonda. Al final, la hebra protectora corta no está unida a nada y el cebador corto no unido es detectable. El resto de esta sección ofrece algunos antecedentes de la investigación necesaria para perfeccionar este proceso y convertirlo en una prueba útil.
En 2012, el grupo de investigación de Yin publicó un artículo sobre la optimización de la especificidad de la hibridación de ácidos nucleicos. [3] Introdujeron una 'sonda de intercambio de dedos (PC)' que consiste en una cadena de complemento C prehibridada y una cadena protectora P. La cadena de complemento es más larga que la cadena protectora y tiene una cola libre en el extremo, un punto de apoyo. El complemento es perfectamente complementario con la secuencia diana. Cuando el objetivo correcto (X) reacciona con la sonda de intercambio de dedos (PC), se libera P y se forma el producto hibridado XC. La energía libre estándar (∆) de la reacción es cercana a cero. Por otro lado, si la sonda de intercambio (PC) reacciona con un objetivo (S) espurio, la reacción avanza, pero la energía libre estándar aumenta para ser menos termodinámicamente favorable. La diferencia de energía libre estándar (∆∆) es lo suficientemente significativa como para dar una discriminación obvia en el rendimiento. El factor de discriminación Q se calcula como el rendimiento de la hibridación objetivo correcta dividido por el rendimiento de la hibridación objetivo espuria. A través de experimentos con diferentes sondas de intercambio de puntos con 5 objetivos correctos y 55 objetivos falsos con cambios de base única energéticamente representativos (reemplazos, eliminaciones e inserciones), el grupo de Yin concluyó que los factores de discriminación de estas sondas estaban entre 3 y 100+ con la mediana 26. Las sondas funcionan de manera robusta entre 10 °C y 37 °C, de 1 mM a 47 mM, y con concentraciones de ácido nucleico de 1 nM a 5 M. También descubrieron que las sondas de intercambio de dedos funcionan de manera sólida incluso en la detección de ARN.
Posteriormente se han estudiado más investigaciones. En 2013, el grupo de Seelig publicó un artículo sobre sondas moleculares fluorescentes que también utiliza la reacción de intercambio de dedos. [4] Esto permitió la detección óptica del objetivo correcto y del objetivo SNP. También lograron la detección de SNP en muestras derivadas de E. coli.
En 2015, el grupo de David logró una selectividad extremadamente alta (más de 1000) de variantes de un solo nucleótido (SNV) al introducir el sistema llamado "composiciones competitivas". [5] En este sistema, construyeron un modelo de reacción cinética de los procesos de hibridación subyacentes para predecir los valores óptimos de los parámetros, que varían según las secuencias de SNV y de tipo salvaje (WT), de la arquitectura de diseño de la sonda y el sumidero, y de las concentraciones de reactivos y las condiciones del ensayo. Su modelo logró una selectividad media de 890 veces para 44 SNV de ADN relacionados con el cáncer, con un mínimo de 200, lo que representa al menos una mejora de 30 veces con respecto a ensayos anteriores basados en hibridación. Además, aplicaron esta tecnología para analizar secuencias de VAF bajo de ADN genómico humano después de la PCR, así como directamente a secuencias de ARN sintético.
Basándose en la experiencia, desarrollaron un nuevo método de PCR llamado Blocker Displacement Amplification (BDA). [6] Es una PCR resistente a la temperatura que amplifica selectivamente todas las variantes de secuencia dentro de una ventana de aproximadamente 20 nt por 1000 veces más que las secuencias de tipo salvaje, lo que permite una fácil detección y cuantificación de cientos de variantes potenciales originalmente con una frecuencia de alelo ≤ 0,1%. BDA logra un rendimiento de enriquecimiento similar en temperaturas de recocido que oscilan entre 56 °C y 64 °C. Esta robustez de la temperatura facilita el enriquecimiento multiplexado de muchas variantes diferentes en todo el genoma y, además, permite el uso de instrumentos de termociclado portátiles y económicos para la detección de variantes raras de ADN. BDA se ha validado incluso en tipos de muestras que incluyen muestras clínicas de ADN libre de células extraídas del plasma sanguíneo de pacientes con cáncer de pulmón.