KaiB es un gen ubicado en el grupo de genes kaiABC altamente conservado de varias especies de cianobacterias . Junto con KaiA y KaiC , KaiB desempeña un papel central en el funcionamiento del reloj circadiano de las cianobacterias. El descubrimiento de los genes Kai marcó la primera identificación de un oscilador circadiano en una especie procariota . Además, la caracterización del reloj de las cianobacterias demostró la existencia de mecanismos postraduccionales independientes de la transcripción para la generación del ritmo, lo que pone en tela de juicio la universalidad del modelo de bucle de retroalimentación de transcripción-traducción de la ritmicidad circadiana.
En el pasado se creía que los ritmos circadianos (oscilaciones endógenas y controlables en los procesos biológicos con períodos que corresponden aproximadamente a un día de 24 horas) eran una propiedad exclusiva de las formas de vida eucariotas. Se pensaba que los procariotas carecían de la complejidad celular necesaria para mantener un ritmo constante y compensado por la temperatura. Además, la "regla circadiana- infradiana ", ampliamente aceptada, estipulaba que las funciones celulares solo podían acoplarse a un oscilador circadiano en células que se dividieran tan rápido como una vez en un período de 24 horas. Los procariotas, que a menudo experimentan divisiones celulares varias veces en un solo día, no cumplían esta condición. [1]
Con el tiempo, la evidencia creciente comenzó a desafiar esta afirmación y apoyó la existencia de un ritmo circadiano bacteriano . Por ejemplo, la separación temporal discreta de la fotosíntesis y la fijación de nitrógeno observada en las cianobacterias sugirió la existencia de algún mecanismo de control circadiano. [2] Finalmente, en 1986 Tan-Chi Huang y colegas descubrieron y caracterizaron ritmos robustos de 24 horas de fijación de nitrógeno en la cianobacteria Synechococcus , demostrando la ritmicidad circadiana en una especie procariota. [3] [4] [5] Después de estos descubrimientos, los cronobiólogos se propusieron identificar los mecanismos moleculares que gobiernan el funcionamiento del reloj de las cianobacterias.
Takao Kondo , Masahiro Ishiura, Susan Golden , Carl Johnson y sus colegas utilizaron la luciferasa bacteriana , un reportero de la expresión génica, en el gen psbAI para monitorear la actividad de este gen del reloj que se encuentra en la cianobacteria Synechococcus . La transformación de un mutante de reloj de período largo de 44 horas, C44a , con una biblioteca de ADN genómico de tipo salvaje (WT) en un vector plasmídico permitió probar "clones de rescate" con un período normal de 25 horas. Cuando la biblioteca de ADN de este clon rescatado se colocó en un plásmido en el sitio original, se encontró que C44a estaba completamente rescatado. Se encontró que un solo grupo de genes, kaiABC , era de naturaleza rítmica cuando se secuenció el fragmento del plásmido responsable del rescate. kaiABC se compone de tres genes individuales: kaiA , kaiB y kaiC . El examen de los patrones de rescate en más de 50 mutantes del reloj que mostraban períodos cortos, períodos largos o arritmia reveló la restauración del fenotipo WT en todos los mutantes. La secuenciación posterior reveló 19 mutantes específicos de kaiABC en total, 14 de los cuales tenían mutaciones en kaiC , 3 en kaiA y 2 en kaiB . [6] Los fenotipos mutantes, todos causados por una única sustitución de aminoácidos en uno de los genes mencionados anteriormente, determinaron que las proteínas Kai desempeñan un papel importante en el reloj circadiano de Synechococcus .
Inicialmente, se pensó que era necesario un ciclo de retroalimentación de transcripción-traducción para crear ritmos circadianos, por lo que se creyó que kaiABC también tendría esta función. Sin embargo, más tarde se descubrió que la inhibición de la acumulación de ARNm de kaiBC utilizando un inhibidor de la transcripción o la traducción no impedía el ciclo circadiano de la fosforilación de kaiC. Por lo tanto, es cierto que la ritmicidad del reloj de las cianobacterias es independiente tanto de la transcripción como de la traducción. [7] Además, se realizaron experimentos para probar la oscilación autosostenible de la fosforilación de KaiC, que es importante en la regulación del grupo de genes kaiABC . Al incubar KaiC junto con KaiA y KaiB, así como ATP, se demostró el aspecto de compensación de temperatura del reloj de KaiABC. Además, dichos períodos circadianos observados en mutantes de kaiC in vivo también se observaron en cepas in vitro . [8]
Las cianobacterias son un grupo de bacterias fotosintéticas fijadoras de nitrógeno que se sabe que fueron una de las primeras formas de vida en la Tierra y se cree que surgieron hace al menos 3500 millones de años (Mya). Son los únicos procariotas fotosintéticos oxidativos conocidos. [9] Las cianobacterias utilizan relojes circadianos para regular la fijación de nitrógeno, la división celular y otros procesos metabólicos. La gran mayoría de los genes de las cianobacterias se expresan de manera circadiana y generalmente se clasifican en las categorías de Clase I (pico al anochecer) y Clase II (pico al amanecer) según su función específica. [10]
La expresión rítmica de los genes de las cianobacterias está impulsada por la oscilación en el estado de fosforilación del oscilador Kai y su interacción con varios mecanismos de salida. La evolución de los tres genes kai –kaiA , kaiB y kaiC– sigue siendo un área de estudio activo. Evidencia filogenética reciente sugiere que los genes kai surgieron secuencialmente: kaiC hace casi 3.800 millones de años, kaiB entre 3.500 y 2.3200 millones de años y kaiA más recientemente hace alrededor de 1.000 millones de años. La fusión de kaiC y kaiB en un operón bajo el control de un único promotor ocurrió poco después de la aparición de kaiB en el genoma. [9]
Si bien los tres genes kai son necesarios de forma independiente para mantener el ritmo circadiano en las cianobacterias, el gen kaiA está restringido a un grupo de cianobacterias de orden superior. Por ejemplo, si bien los géneros de cianobacterias Synechococcus y Prochlorococcus están estrechamente relacionados, el gen kaiA está ausente en las especies de Prochlorococcus . Las cianobacterias que carecen de kaiA muestran oscilaciones en la expresión génica y la progresión del ciclo celular, pero estos ritmos no son autosostenibles y desaparecen rápidamente en condiciones constantes. [11]
A diferencia de las especies de cianobacterias que carecen de genes kai , algunos miembros de la familia Synechococcus expresan parálogos de kaiB y kaiC denominados kaiC2 , kaiB2 , kaiC3 y kaiB3 . [9] La función de este conjunto ampliado de genes del reloj sigue siendo especulativa, pero la evidencia actual sugiere que estos parálogos ayudan a ajustar un ritmo circadiano central establecido por kaiA , kaiB1 y kaiC1 . [10]
Se han identificado ortólogos de los genes kaiB y kaiC en algunas especies de Archaea y Pseudomonadota . Probablemente originados por transferencia lateral, algunos de estos ortólogos –particularmente en casos en los que kaiB y kaiC son coincidentes– han sido implicados tentativamente en mecanismos rudimentarios de cronometraje. [9] [12] Otros desempeñan papeles en procesos celulares sorprendentemente divergentes, como las respuestas al estrés oxidativo y salino de Legionella pneumophila . [13]
El oscilador circadiano central de las cianobacterias, codificado por los genes kaiA , kaiB y kaiC , regula los patrones globales de expresión génica y gobierna procesos celulares esenciales, como la fotosíntesis y la división celular. Los ritmos cíclicos y secuenciales de fosforilación y desfosforilación de KaiC constituyen el mecanismo de cronometraje del oscilador tanto in vivo como in vitro .
KaiC está organizado como un homohexámero en forma de anillo. Cada componente monomérico contiene cuatro motivos estructurales esenciales: un dominio CI, un dominio CII, un dominio de unión de bucle B y una cola que sobresale del extremo C conocido como bucle A. Debido a que los dominios CI y CII están alineados en el hexámero KaiC, se los conoce colectivamente como anillos CI y CII. [14] KaiC tiene actividad intrínseca de autoquinasa y autofosfato, cada una de las cuales puede ser modulada por la unión de KaiA y KaiB. En particular, la fosforilación y desfosforilación de los residuos Ser431 y Thr432 en el anillo CII impulsan los ritmos circadianos en el oscilador Kai. [15]
Al comienzo del día subjetivo, los residuos Ser431 y Thr432 del hexámero KaiC no están fosforilados y los dominios de bucle A de sus monómeros constituyentes están expuestos. KaiA se une al dominio de bucle A de KaiC, lo que promueve la actividad de autoquinasa. La fosforilación de la proteína se produce de manera ordenada y secuencial: Thr432 se fosforila primero, seguido de Ser431. La fosforilación del residuo Ser431 impulsa un cambio conformacional significativo en el hexámero KaiC. Los anillos CI y CII del complejo proteico se apilan más firmemente, exponiendo el bucle B previamente ocluido. El bucle B, a su vez, recluta a KaiB, que se une simultáneamente a KaiA y KaiC. La unión de KaiB elimina a KaiA del bucle A y, a su vez, promueve la actividad de autofosfatasa de KaiC e inhibe su actividad de autoquinasa. La desfosforilación de KaiC ocurre en la noche subjetiva y procede en el orden inverso a la fosforilación; Thr432 se desfosforila antes que Ser431. [10]
En última instancia, estos ritmos circadianos en la fosforilación de KaiC regidos por la unión de KaiA y KaiB crean un oscilador postraduccional que puede interactuar tanto con las vías de entrada para adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes como con las vías de salida para mediar en los eventos transcripcionales.
Aunque el oscilador Kai es capaz de generar ritmos endógenos en la fosforilación, no influye directamente en la expresión génica; ninguna de las proteínas Kai posee dominios de unión al ADN. En cambio, un sistema de dos componentes que consiste en SasA, una histidina quinasa , y RpaA, un factor de transcripción, conecta los cambios en la fosforilación de KaiC con eventos transcripcionales.
SasA puede unirse al bucle B expuesto de la molécula KaiC tras la fosforilación del residuo Ser431. Esta interacción impulsa la autofosforilación de SasA y la posterior transferencia de fosfo a RpaA. La fosfo-RpaA activa la expresión de los genes de anochecer-pico (clase 1) y reprime la expresión de los genes de amanecer-pico (clase 2). Por el contrario, la RpaA no fosforilada reprime la expresión de los genes de clase 1. Como resultado, la fosforilación rítmica del factor de transcripción, impulsada por el oscilador Kai y la actividad asociada de SasA, produce patrones rítmicos en la expresión génica. [16]
KaiB actúa como un importante regulador de la vía SasA-RpaA y presenta adaptaciones estructurales que contribuyen a la generación del ritmo circadiano y facilitan la interacción con SasA y KaiC. La mayor parte de KaiB expresada en cianobacterias existe como un homotetrámero inactivo, incapaz de interactuar con KaiC. El tetrámero KaiB existe en equilibrio con una forma monomérica de la proteína. Sin embargo, KaiB monomérica debe sufrir un cambio radical en la estructura terciaria para asociarse con KaiC, pasando de una conformación denominada de estado fundamental (gs-KaiB) a una conformación de cambio de pliegue (fs-KaiB) capaz de unirse al bucle B de KaiC. Hasta la fecha, KaiB es la única proteína de reloj metamórfica conocida, una clase de proteínas capaces de cambiar de pliegue de forma reversible. [10]
Fs-KaiB tiene un pliegue similar al de la tiorredoxina que se asemeja mucho al extremo N de SasA y desplaza competitivamente la unión de la quinasa a KaiC. Sin embargo, el cambio de conformación de gs-KaiB a fs-KaiB ocurre lentamente, lo que permite la unión de SasA a KaiC y la activación posterior de RpaA desde el mediodía (cuando el bucle B queda expuesto por primera vez) hasta el anochecer. [17] Como resultado, la fosfo-RpaA se acumula a medida que avanza el día y alcanza su pico cerca del anochecer, lo que sincroniza apropiadamente los aumentos en la expresión de los genes de clase 1. Además, este desfase temporal en la unión de KaiB retrasa el inicio de la actividad de la autofosfatasa en KaiC, lo que contribuye al período circadiano del oscilador cianobacteriano.
Si bien la ritmicidad en el oscilador KaiABC se puede reconstituir in vitro , el reloj está sujeto a varios niveles adicionales de regulación in vivo . Por ejemplo, se debe mantener una relación estequiométrica de los componentes del reloj para preservar la ritmicidad. [18] kaiB y kaiC , cuyos niveles de transcripción y proteína oscilan considerablemente a lo largo del día, constituyen un operón bajo el control de un solo promotor y se transcriben como un ARNm policistrónico. Por el contrario, los niveles de proteína de KaiA, que se encuentra bajo el control de un promotor independiente, permanecen bastante estables durante un período de 24 horas. [10] [19]
Además, la fase del oscilador Kai puede cambiar en respuesta a cambios ambientales. Sin embargo, a diferencia de los mecanismos de cambio de fase caracterizados en organismos eucariotas, los fotopigmentos no parecen desempeñar un papel en el arrastre del reloj de las cianobacterias. En cambio, los mecanismos de entrada identificados se basan en cambios bioquímicos que rastrean las reacciones fotosintéticas realizadas por la cianobacteria, reacciones que exhiben aumentos de velocidad proporcionales a la intensidad de la luz ambiental. CikA y LdpA, por ejemplo, detectan el estado redox del entorno intracelular y transmiten los cambios al oscilador Kai. [20] Además, KaiA y KaiC parecen detectar directamente los metabolitos de la fotosíntesis, específicamente la quinona y el ATP , y ajustar la fase del oscilador en consecuencia. [20] [21] Hasta la fecha, KaiB no ha sido implicado en una vía de entrada capaz de arrastrar el reloj de las cianobacterias.
Tanto el laboratorio del Dr. Carl Johnson en la Universidad de Vanderbilt como el del Dr. Michael Rust en la Universidad de Chicago han centrado sus esfuerzos de investigación en el complejo KaiABC. El laboratorio de Johnson, en colaboración con el laboratorio del Dr. Hassane Mchaourab, se centra en el uso de métodos biofísicos para explicar cómo oscila el reloj de las cianobacterias in vitro . Además, esperan descubrir la importancia adaptativa de los ritmos circadianos utilizando mutantes del gen del reloj de las cianobacterias. [22] El laboratorio de Rust está investigando cómo las interacciones de proteínas, neurotransmisores y gradientes iónicos producen el comportamiento de las células de cianobacterias vivas, utilizando una combinación de técnicas como la microscopía bioquímica avanzada y el modelado matemático. [23]