KaiC es un gen que pertenece al grupo de genes KaiABC (con KaiA y KaiB ) que, juntos, regulan los ritmos circadianos bacterianos , específicamente en las cianobacterias . KaiC codifica la proteína KaiC, que interactúa con las proteínas KaiA y KaiB en un oscilador postraduccional (PTO). El PTO es el reloj maestro de las cianobacterias que está controlado por secuencias de fosforilación de la proteína KaiC. [1] [2] La regulación de la expresión de KaiABC y la fosforilación de KaiABC es esencial para la ritmicidad circadiana de las cianobacterias , y es particularmente importante para regular procesos de las cianobacterias como la fijación de nitrógeno , la fotosíntesis y la división celular . [3] Los estudios han demostrado similitudes con los modelos de reloj de Drosophila , Neurospora y mamíferos en que la regulación de kaiABC del reloj circadiano esclavo de las cianobacterias también se basa en un bucle de retroalimentación de transcripción-traducción (TTFL). [4] La proteína KaiC tiene actividad tanto de autoquinasa como de autofosfatasa y funciona como regulador circadiano tanto en el PTO como en el TTFL. Se ha descubierto que KaiC no solo suprime la expresión de kaiBC cuando se sobreexpresa, sino que también suprime la expresión circadiana de todos los genes en el genoma de las cianobacterias . [5]
Aunque se ha descubierto que el grupo de genes KaiABC existe solo en cianobacterias, evolutivamente KaiC contiene homólogos que se encuentran en Archaea y Pseudomonadota . Es el gen circadiano más antiguo que se ha descubierto en procariotas. KaiC tiene una estructura y secuencia de doble dominio que lo clasifica como parte de la familia de genes RecA de recombinasas dependientes de ATP . [3] Con base en una serie de genes homólogos de dominio único en otras especies, se plantea la hipótesis de que KaiC se transfirió horizontalmente de Bacteria a Archaea, formando finalmente el KaiC de doble dominio a través de duplicación y fusión . El papel clave de KaiC en el control circadiano y la homología con RecA sugieren su evolución individual antes de su presencia en el grupo de genes KaiABC . [4]
Masahiro Ishiura, Takao Kondo , Susan S. Golden , Carl H. Johnson y sus colegas descubrieron el grupo de genes en 1998 y lo llamaron kaiABC, ya que "kai" significa "ciclo" en japonés. Generaron 19 mutantes de reloj diferentes que se asignaron a los genes kaiA, kaiB y kaiC, y clonaron con éxito el grupo de genes en la cianobacteria Synechococcus elongatus . Usando un reportero de luciferasa bacteriana para monitorear la expresión del gen psbAI controlado por reloj en Synechococcus, investigaron e informaron sobre el rescate a la ritmicidad normal del mutante de reloj de período largo C44a (con un período de 44 horas) por kaiABC. Insertaron ADN de tipo salvaje a través de un vector plasmídico pNIBB7942 en el mutante C44a y generaron clones que restauraron el período normal (un período de 25 horas). Finalmente, lograron localizar la región del gen que causaba este rescate y observaron un ritmo circadiano en la actividad promotora ascendente de kaiA y kaiB, así como en la expresión del ARN mensajero de kaiA y kaiBC . Determinaron que la abolición de cualquiera de los tres genes kai causaría arritmicidad en el reloj circadiano y reduciría la actividad promotora de kaiBC. [3] Más tarde se descubrió que KaiC tenía actividad tanto de autoquinasa como de autofosfatasa . [1] Estos hallazgos sugirieron que el ritmo circadiano estaba controlado por un mecanismo TTFL, lo que es consistente con otros relojes biológicos conocidos. [6]
En 2000, se observó a S. elongatus en oscuridad constante (DD) y luz constante (LL). En DD, la transcripción y la traducción se detuvieron debido a la ausencia de luz, pero el mecanismo circadiano no mostró un cambio de fase significativo después de la transición a la luz constante. [7] En 2005, después de un examen más detallado de las interacciones de la proteína KaiABC, se demostró que la fosforilación de KaiC oscilaba con ritmos diarios en ausencia de luz. [8] Además del modelo TTFL, se planteó la hipótesis del modelo PTO para el ciclo de fosforilación de KaiABC. [6]
También en 2005, Nakajima et al. lisaron S. elongatus y aislaron las proteínas KaiABC. En tubos de ensayo que contenían solo proteínas KaiABC y ATP , la fosforilación in vitro de KaiC osciló con un período cercano a las 24 horas con una amplitud ligeramente menor que la oscilación in vivo , lo que demuestra que las proteínas KaiABC son suficientes para el ritmo circadiano únicamente en presencia de ATP. [9] Combinado con el modelo TTFL, se demostró que KaiABC como PTO circadiano es el regulador fundamental del reloj en S. elongatus [6]
En el cromosoma circular singular de Synechococcus elongatus , el gen codificador de proteínas kaiC se encuentra en la posición 380696-382255 (su etiqueta de locus es syc0334_d). El gen kaiC tiene parálogos [ dudoso – discutir ] kaiB (ubicado 380338..380646) y kaiA (ubicado 379394..380248). kaiC codifica la proteína KaiC (519 aminoácidos ). KaiC actúa como un regulador de transcripción no específico que reprime la transcripción del promotor kaiBC . Su estructura cristalina ha sido resuelta a una resolución de 2,8 Å ; es un complejo homohexamérico (aproximadamente 360 kDa ) con una estructura de doble rosquilla y un poro central que está abierto en los extremos N-terminales y parcialmente sellado en los extremos C-terminales debido a la presencia de seis residuos de arginina . [5] El hexámero tiene doce moléculas de ATP entre los dominios N-(CI) y C-terminal (CII), que demuestran la actividad de ATPasa. [10] Los dominios CI y CII están unidos por la región N-terminal del dominio CII. Los últimos 20 residuos del C-terminal del dominio CII sobresalen de la rosquilla para formar lo que se llama el bucle A. [1] Las interfaces en el dominio CII de KaiC son sitios para la actividad de autoquinasa y autofosfatasa, tanto in vitro como in vivo . [11] [12] KaiC tiene dos bucles P o motivos de Walker As ( motivos de unión de ATP -/ GTP ) en los dominios CI y CII; el dominio CI también contiene dos motivos DXXG (X representa cualquier aminoácido) que están altamente conservados entre la superfamilia de GTPasas . [13]
KaiC comparte similitudes estructurales con varias otras proteínas con anillos hexaméricos, incluyendo RecA , DnaB y ATPases . Los anillos hexaméricos de KaiC se parecen mucho a RecA, con 8 hélices α que rodean una lámina β retorcida formada por 7 hebras. Esta estructura favorece la unión de un nucleótido en el extremo carboxilo de la lámina β. Las similitudes estructurales de KaiC con estas proteínas sugieren un papel para KaiC en la regulación de la transcripción. Además, el diámetro de los anillos en KaiC es adecuado para acomodar ADN monocatenario . Además, el potencial de superficie en el anillo CII y la apertura del canal C-terminal es mayoritariamente positivo. La compatibilidad del diámetro, así como la carga del potencial de superficie, sugiere que el ADN puede ser capaz de unirse a la apertura del canal C-terminal. [14]
Las proteínas Kai regulan la expresión génica en todo el genoma. [8] La proteína KaiA mejora la fosforilación de la proteína KaiC al unirse al bucle A del dominio CII para promover la actividad de la auto-quinasa durante el día subjetivo. [15] La fosforilación en las subunidades ocurre de manera ordenada, comenzando con la fosforilación de la treonina 432 (T432) seguida de la serina 431 (S431) en el dominio CII. Esto conduce a un apilamiento apretado del dominio CII al dominio CI. [16] KaiB luego se une al bucle B expuesto en el dominio CII de KaiC y secuestra a KaiA de los terminales C durante la noche subjetiva, lo que inhibe la fosforilación y estimula la actividad de la auto-fosfatasa. [2] La desfosforilación de T432 ocurre seguida de S431, devolviendo a KaiC a su estado original. [16] [12]
La alteración del dominio CI de KaiC produce una arritmia en la expresión de kaiBC y una reducción de la actividad de unión a ATP; esto, junto con la autofosforilación in vitro de KaiC, indica que la unión de ATP a KaiC es crucial para la oscilación circadiana de Synechococcus . [13] El estado de fosforilación de KaiC se ha correlacionado con la velocidad del reloj de Synechococcus in vivo . [12] Además, se ha demostrado que la sobreexpresión de KaiC reprime fuertemente el promotor de kaiBC , mientras que la sobreexpresión de kaiA ha mejorado experimentalmente el promotor de kaiBC . [5] Estos elementos de unión positivos y negativos reflejan un mecanismo de retroalimentación de generación de ritmo conservado en muchas especies diferentes. [17]
La fosforilación de KaiC oscila con un período de aproximadamente 24 horas cuando se coloca in vitro con las tres proteínas Kai recombinantes, incubadas con ATP. El ritmo circadiano de la fosforilación de KaiC persiste en oscuridad constante, independientemente de las tasas de transcripción de Synechococcus . Se cree que esta tasa de oscilación está controlada por la proporción de proteína KaiC fosforilada a no fosforilada. La proporción de fosforilación de KaiC también es un factor principal en la activación del promotor kaiBC . El operón kaiBC se transcribe de manera circadiana y precede a la acumulación de KaiC en aproximadamente 6 horas, [18] un retraso que se cree que desempeña un papel en los ciclos de retroalimentación.
Se ha demostrado que kaiA , kaiB y kaiC son componentes genéticos esenciales en Synechococcus elongatus para los ritmos circadianos. [18] Los experimentos también han demostrado que KaiC mejora la interacción KaiA-KaiB en células de levadura e in vitro. Esto implica que puede haber la formación de un complejo heteromultimérico compuesto por las tres proteínas Kai con KaiC sirviendo como puente entre KaiA y KaiB. Alternativamente, KaiC puede formar un heterodímero con KaiA o KaiB para inducir un cambio conformacional. [19] Las variaciones en la región C-terminal de cada una de sus proteínas sugieren divergencia funcional entre las proteínas del reloj Kai, [8] sin embargo, existen interdependencias críticas entre los tres parálogos.
Las cianobacterias son los organismos más simples con un mecanismo conocido para la generación de ritmos circadianos . [18] La actividad de ATPasa KaiC está compensada por la temperatura de 25 a 50 grados Celsius [20] y tiene un Q10 de aproximadamente 1,1 (los valores de Q10 alrededor de 1 indican compensación de temperatura). Debido a que el período de fosforilación de KaiC está compensado por la temperatura y concuerda con los ritmos circadianos in vivo , se cree que KaiC es el mecanismo para la sincronización circadiana básica en Synechococcus . [21] Los individuos ∆kaiABC , uno de los mutantes más comunes, crecen tan bien como los individuos de tipo salvaje, pero carecen de ritmicidad. Esto es evidencia de que el grupo de genes kaiABC no es necesario para el crecimiento. [5]
Además de la regulación de la PTO de las actividades de autoquinasa y autofosfatasa de KaiC, también hay evidencia de un TTFL, similar a otros eucariotas, que gobierna el ritmo circadiano en las salidas del reloj. [22] Al estudiar la estructura y las actividades de KaiC, se sugirieron varios roles de KaiC en el TTFL. Las estructuras similares de KaiC a la superfamilia RecA/DnaB sugirieron un posible rol para KaiC en la unión directa al ADN y la promoción de la transcripción. [14] Los experimentos de knock-out (KO) de KaiC determinaron que KaiC era un regulador negativo de la secuencia promotora de kaiBC , pero se encontró que funcionaba a través de una vía separada, SasA/RpaA, ya que se encontró que KaiC no era un factor de transcripción. [23] Sin embargo, la eliminación del PTO no eliminó por completo la ritmicidad en las actividades promotoras de kaiBC , lo que sugiere que el PTO no es necesario para generar ritmos en el TTFL. [24] En verdad, las actividades de KaiC fuera del PTO son todavía relativamente desconocidas.
Experimentos recientes han descubierto que las oscilaciones en el ciclo celular y los ritmos circadianos de Synechococcus están vinculados entre sí a través de un mecanismo unidireccional. El reloj circadiano regula la división celular, permitiéndole que se lleve a cabo solo en ciertas fases. Sin embargo, el ciclo celular no parece tener ningún efecto sobre el reloj circadiano. Cuando se produce la fisión binaria , las células hijas heredan el reloj circadiano de la célula madre y están en fase con ella. La regulación circadiana de la división celular puede ser una característica protectora para evitar la división en una fase vulnerable. Las fases en las que KaiC tiene una actividad ATPasa alta no permiten que se produzca la división celular. En mutantes con una actividad ATPasa de KaiC constantemente elevada, la proteína CikA está ausente. CikA es un factor importante en la vía de entrada y causa la elongación celular dependiente de KaiC. [25]
La recreación de un oscilador circadiano in vitro en presencia únicamente de KaiA, KaiB, KaiC y ATP ha despertado interés en la relación entre los osciladores bioquímicos celulares y sus bucles de retroalimentación de transcripción-traducción (TTFL) asociados. Durante mucho tiempo se ha asumido que los TTFL son el núcleo de la ritmicidad circadiana, pero esa afirmación ahora se está poniendo a prueba nuevamente debido a la posibilidad de que los osciladores bioquímicos puedan constituir el mecanismo central del sistema de reloj, regulando y operando dentro de los TTFL que controlan la salida y restauran las proteínas esenciales para los osciladores en los organismos, como el sistema KaiABC en Synechococcus . [26] Se han propuesto dos modelos para describir la relación entre la regulación bioquímica y TTFL de los ritmos circadianos: un sistema de oscilador maestro/esclavo con el oscilador TTFL sincronizado con el oscilador bioquímico y un sistema de oscilador acoplado igualmente ponderado en el que ambos osciladores se sincronizan e influyen en el otro oscilador. Ambos son modelos de osciladores acoplados que explican la alta estabilidad del mecanismo de sincronización dentro de Synechococcus . El oscilador bioquímico se basa en interacciones moleculares redundantes basadas en la ley de acción de masas , mientras que el TTFL se basa en la maquinaria celular que media la traducción, transcripción y degradación del ARNm y las proteínas. Los diferentes tipos de interacciones que impulsan los dos osciladores permiten que el reloj circadiano sea resistente a los cambios dentro de la célula, como la fluctuación metabólica, los cambios de temperatura y la división celular. [27]
Aunque el período del reloj circadiano está compensado por la temperatura, la fosforilación de KaiC puede sincronizarse de forma estable con un ciclo de temperatura. La fosforilación de KaiC se sincroniza con éxito in vitro con ciclos de temperatura con períodos de entre 20 y 28 horas utilizando pasos de temperatura de 30 °C a 45 °C y viceversa. Los resultados reflejan un cambio dependiente de la fase en la fase de los ritmos de fosforilación de KaiC. El período del reloj circadiano no se modificó, lo que refuerza la compensación de temperatura del mecanismo del reloj. [28]
Un estudio de 2012 de la Universidad de Vanderbilt muestra evidencia de que KaiC actúa como una fosfotransferasa que devuelve fosfatos a ADP en T432 (residuo de treonina en la posición 432) y S431 (residuo de serina 431), lo que indica que KaiC actúa efectivamente como una ATP sintasa . [10]
Se han identificado varios mutantes de KaiC y se han estudiado sus fenotipos. Muchos mutantes muestran un cambio en el período de sus ritmos circadianos.
[9] [29]