También apareció en películas como New York Minute (2004), El vuelo del Fénix (2004) y La casa de cera (2005).
[1] En 2005, fue seleccionado para interpretar a Sam Winchester en la serie Supernatural, la cual se convirtió en un éxito en términos de audiencia y en críticas, hecho que llevó a The CW a extenderla por quince temporadas, con lo que se convirtió en el programa de fantasía más largo de la televisión estadounidense y en el más longevo del canal.
Por otra parte, Padalecki ha apoyado a varias asociaciones benéficas en favor de la salud mental.
Tiene ascendencia polaca por su padre (de allí su apellido), así como británica, francesa y alemana por su madre.
[5][9] Aunque se enfocó solo en Supernatural durante finales de los 2000, realizó pequeños papeles en Room 401 y Viernes 13 (2009).
En marzo de 2015, lanzó una campaña por el sitio Represent.com llamada Always Keep FIghting para recaudar fondos para la fundación To Write Love on Her Arms, que busca ayudar a personas con depresión, ansiedad y pensamientos suicidas.