El sistema Strep-tag es un método que permite la purificación y detección de proteínas mediante cromatografía de afinidad . El Strep-tag II es un péptido sintético que consta de ocho aminoácidos ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Esta secuencia peptídica muestra afinidad intrínseca hacia Strep-Tactin, una estreptavidina diseñada específicamente , y puede fusionarse N- o C-terminalmente a proteínas recombinantes. Al explotar la interacción altamente específica, las proteínas marcadas con Strep pueden aislarse en un solo paso a partir de lisados celulares crudos. Debido a que el Strep -tag eluye en condiciones fisiológicas suaves, es especialmente adecuado para la generación de proteínas funcionales. [1] [2]
Strep-tag, Twin-Strep-tag y Strep-Tactin son marcas registradas de IBA Lifesciences GmbH .
La estreptavidina es una proteína tetramérica expresada en Streptomyces avidinii . Debido a la alta afinidad de la estreptavidina por la vitamina H ( biotina ), la estreptavidina se utiliza comúnmente en los campos de la biología molecular y la biotecnología . El Strep-tag se seleccionó originalmente de una biblioteca genética para unirse específicamente a una versión "central" truncada proteolíticamente de la estreptavidina. Con el paso de los años, el Strep-tag se optimizó sistémicamente para permitir una mayor flexibilidad en la elección del sitio de unión. Además, su socio de interacción, la estreptavidina, también se optimizó para aumentar la capacidad de unión de péptidos, lo que resultó en el desarrollo de Strep-Tactin. La afinidad de unión de Strep-tag a Strep-Tactin es casi 100 veces mayor que la de Strep-tag a estreptavidina. El llamado sistema Strep-tag, que consta de Strep-tag y Strep-Tactin, ha demostrado ser particularmente útil para el aislamiento funcional y el análisis de complejos proteicos en la investigación del proteoma . [3]
Al igual que otras etiquetas de afinidad corta ( His-tag , FLAG-tag ), la etiqueta Strep se puede fusionar fácilmente a proteínas recombinantes durante la subclonación de su ADNc o gen . Para su expresión, están disponibles varios vectores para varios organismos hospedadores ( E. coli , levadura , insecto y células de mamíferos ). [4] Un beneficio particular de la etiqueta Strep es su tamaño bastante pequeño y el hecho de que es bioquímicamente casi inerte . Por lo tanto, el plegamiento o secreción de proteínas no se ve influenciado y generalmente no interfiere con la función de la proteína. La etiqueta Strep es especialmente adecuada para el análisis de proteínas funcionales, porque el procedimiento de purificación se puede mantener en condiciones fisiológicas. Esto no solo permite el aislamiento de proteínas sensibles en un estado nativo, sino que también es posible purificar complejos proteicos intactos, [5] incluso si solo una subunidad lleva la etiqueta.
En el primer paso del ciclo de purificación de Strep-tag, el lisado celular que contiene la proteína de fusión Strep-tag se aplica a una columna con Strep-Tactin inmovilizado (paso 1). Después de que la proteína marcada se haya unido específicamente a Strep-Tactin, un breve paso de lavado con un tampón fisiológico (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, PBS) elimina todas las demás proteínas del huésped (paso 2). Esto se debe a la baja tendencia de Strep-Tactin a unirse a proteínas de forma no específica. A continuación, la proteína de fusión Strep-tag purificada se eluye suavemente con una baja concentración de destiobiotina, que compite específicamente por el bolsillo de unión de la biotina (paso 3). Para regenerar la columna, se elimina la destiobiotina mediante la aplicación de una solución que contiene HABA (un colorante azo amarillo ). La eliminación de la destiobiotina se indica mediante un cambio de color de amarillo anaranjado a rojo (paso 4+5). Finalmente, la solución HABA se lava con un pequeño volumen de tampón de ejecución, lo que deja la columna lista para su uso en la siguiente ejecución de purificación.
El sistema Strep-tag ofrece una herramienta selectiva para purificar proteínas en condiciones fisiológicas. Las proteínas obtenidas son bioactivas y presentan una pureza muy alta (superior al 95%). Además, el sistema Strep-tag se puede utilizar para la detección de proteínas en diversos ensayos. Dependiendo de las circunstancias experimentales, se pueden utilizar anticuerpos Strep-tag o Strep-Tactin, con un marcador enzimático (p. ej. peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP)) o fluorescente (p. ej. proteína fluorescente verde (GFP)). Si se requiere una alta pureza, el lisado se puede purificar utilizando primero Strep-Tactin y luego realizar una segunda ejecución utilizando anticuerpos contra Strep-tag. Esto reduce la contaminación con proteínas unidas de forma inespecífica, lo que podría ocurrir en algunos escenarios poco frecuentes.
Se pueden realizar los siguientes ensayos utilizando el sistema de detección Strep-tag:
Debido a que el Strep-tag es capaz de aislar complejos proteicos, también se pueden llevar a cabo estrategias para el estudio de interacciones proteína-proteína. Otra opción es la inmovilización de proteínas Strep-tag con un anticuerpo específico de alta afinidad en microplacas o biochips.
El sistema Strep-Tag/StrepTactin también se utiliza en pinzas ópticas de una sola molécula y en experimentos con microscopio de fuerza atómica , mostrando una alta estabilidad mecánica comparable a los enlaces no covalentes más fuertes actualmente disponibles. [6]