Jugó la mayor parte de su carrera en Boca Juniors, donde permaneció durante 10 temporadas, desde 1997 hasta 2007.

Su último equipo fue Gimnasia y Esgrima de La Plata, club donde inició su carrera como futbolista.

Se inició futbolísticamente en Gimnasia y Esgrima de La Plata, donde debutó profesionalmente en el año 1991.

A mediados de 1997, llega a Boca Juniors, junto con su hermano mellizo Gustavo Barros Schelotto y Martín Palermo, por recomendación de Diego Armando Maradona, quien, en ese momento, se encontraba en el club.

Con dicho equipo conquistaría la Copa Sudamericana 2013, siendo este su primer título en condición de entrenador.

Luego dirigió durante tres años a Boca Juniors, con el que ganó los Campeonatos de Primera División 2016-17 y 2017-18.

[4]​[5]​ En los torneos Clausura y Apertura que seguirían el equipo platense obtuvo como máximo un séptimo lugar.

El Clausura 1995 representó una de las mayores oportunidades del club para conseguir su primer título nacional en la era profesional.

Con su hermano mellizo Gustavo compartía un carácter díscolo que los llevó a no pocos roces con rivales y árbitros.

[7]​[8]​[9]​ En la decimocuarta ronda, se enfrentó en casa al club con quién disputaba el liderazgo, Vélez Sarsfield, sufriendo un empate a siete minutos del final.

Los tres, fueron repetidamente recomendados a Boca por Diego Maradona, quien estaba jugando su última temporada para el equipo porteño, retirándose en octubre del mismo año.

Los primeros tiempos en Boca los vivió desde el banco de suplentes, postergado por Claudio Caniggia.

Pero aún entrando en los segundos tiempos tuvo actuaciones destacadas, como en su debut con la camiseta xeneize ingresando en el segundo tiempo y marcando frente a Newell's Old Boys en la victoria por 2-1 el 14 de septiembre de 1997.

Si bien en sus primeros años no marcó mucho frente a River Plate, ni tampoco pudo destacarse jugando en el Monumental, sus picantes duelos con jugadores y cuerpo técnico rivales trascendieron el campo de juego.

Por su rendimiento en la temporada 2008 de la MLS, Barros Schelotto fue nombrado Sports Illustrated Latino's Sportsman of the Year.

[16]​ Barros Schelotto fue elegido para participar en el «2010 MLS Re-Entry Draft» y se convirtió en agente libre en la Major League Soccer, cuando no fue seleccionado en dicho proyecto.

[17]​ Dando muestra de su cariño por la institución, Guillermo decidió firmar el contrato obligatorio para la AFA y jugar gratis (es decir, sin cobrar sueldo alguno) en beneficio del club.

Luego de un triunfo en un partido repechaje contra Huracán, Guillermo se retiró del fútbol en el empate 1-1 contra San Martín de San Juan, resultado que relegó a Gimnasia al Nacional B.

En la pelea por el título se encontraba además River, equipo que visita al Granate anteúltima jornada.

Lanús vence al conjunto millonario con una goleada histórica por 5-1, pero tenía que completar un partido frente a Estudiantes en La Plata.

Lanús debía revertir un 0-2 en contra en los 45 minutos restantes, para mantenerse con chances hasta la última fecha.

En cuartos se cruza con River Plate, empatando 0-0 como local y ganando por 3-1 en el Monumental.

Lanús obtiene un claro triunfo por 2-0, con goles de Víctor Ayala e Ismael Blanco, consagrándose así como campeón del certamen.

Lanús pierde Recopa Sudamericana en Belo Horizonte por un resultado global de 5-3 en tiempo suplementario.

Sin embargo, el equipo cayó en las semifinales de conferencia tras perder 5-3 contra Los Angeles FC.

En el torneo realizado durante la pandemia, MLS is Back, LA Galaxy queda eliminado en la fase de grupos.

En esta instancia, Barros Schelotto anotaría su remate, el tercero en la definición desde los doce pasos, la cual ganaría finalmente Argentina por 5 a 4.

[27]​ Disputó la primera fase como titular, siendo sustituido luego en tres partidos y acabó no siendo utilizado en los cuartos de final, cuando la albiceleste fue eliminada por su eterno rival, Brasil.

[27]​ Barros Schelotto sería convocado esporádicamente hasta su última aparición para Argentina, en el año 1999, totalizando apenas 10 partidos y cero goles para su país.

Su hermano gemelo Gustavo fue compañero suyo en Gimnasia, y también, por poco tiempo, en Boca Juniors.