Aunque también es activo, en menor medida, para bacterias grampositivas, como Staphylococcus aureus o Enterococcus faecalis, se prefiere el uso de medicamentos menos tóxicos.

No obstante, por su toxicidad sistémica se restringe su uso a situaciones que representan un riesgo para la vida del paciente, usualmente en combinación con cefalosporinas o penicilinas, como es el caso de infecciones por Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter y Proteus.

[8]​ Esta clase de infecciones se pueden tratar indistintamente con gentamicina, tobramicina, amikacina o netilmicina.

[11]​ Por vía tópica sirve para el tratamiento de impétigo, úlceras por decúbito infectadas, quemaduras o piodermatitis, entre otras condiciones.

[1]​ Se ha utilizado también, en dosis bajas y en combinación con vancomicina o penicilinas, para el tratamiento de infecciones por grampositivos en algunas circunstancias, principalmente endocarditis bacteriana.

[8]​ Como en otros aminoglucósidos, los principales efectos secundarios de la gentamicina son nefrotoxicidad, ototoxicidad,[8]​ neurotoxicidad y bloqueo neuromuscular.

[13]​ La ototoxicidad suele ser irreversible y se presenta como disfunción vestibular o pérdida de la audición.

Otros posibles efectos secundarios son náuseas, vómito, diarrea, palpitaciones, hipotensión, hipertensión o urticaria.

[10]​ La gentamicina está contraindicada en los casos de hipersensibilidad a los aminoglucósidos, pacientes con insuficiencia renal, botulismo, miastenia gravis, parkinsonismo y mujeres embarazadas o durante la lactancia.

[3]​ También se usa con precaución en individuos con enfermedad hepática, deshidratación, pérdida de la audición preexistente o que ya estén recibiendo fármacos nefrotóxicos u ototóxicos.