Entre sus estudiantes se encuentran el fisiólogo Nathan Zuntz (1847-1920) y el químico Hugo Paul Friedrich Schulz (1853-1932).
Pflüger llevó a cabo investigaciones en el sistema nervioso de animales inferiores y fundó en 1868 la revista Archiv für die gesamte Physiologie; además de ser autor de obras como Sensorische Funktionen des Rückenmarks der Wirbeltiere (1853), Physiologie des Elektrotonus (1859), Untersuchungen aus dem physiologischen Laboratorium zu Bonn (1865) y Ueber die Kunst der Verlängerung des Lebens (1890).
En 1868 fundó el Archiv für die gesammte Physiologie (El archivo Pflüger: Revista Europea de Fisiología), que se convirtió en la revista más influyente de fisiología en Alemania.
Pflüger demostró que la oxidación sucede en los tejidos periféricos y no en la sangre, y que la sangre sólo era responsable de transportar los gases respiratorios.
En embriología fisiológica destacan sus trabajos en los ochenta en torno a la determinación del sexo en las ranas y más adelante sus experimentos sobre los efectos de la gravedad en el plano del clivaje.