Los vectores de transformación de plantas son plásmidos que han sido diseñados específicamente para facilitar la generación de plantas transgénicas . Los vectores de transformación de plantas más comúnmente utilizados son los vectores binarios de ADN-T y a menudo se replican tanto en E. coli , una bacteria de laboratorio común , como en Agrobacterium tumefaciens , una bacteria virulenta para las plantas que se utiliza para insertar el ADN recombinante en las plantas.
Los vectores de transformación de plantas contienen tres elementos clave:
Se puede crear y replicar una secuencia de plásmido de ADN personalizada de varias maneras, pero en general, todos los métodos comparten los siguientes procesos:
La transformación de plantas mediante plásmidos comienza con la propagación del vector binario en E. coli. Cuando el cultivo bacteriano alcanza la densidad adecuada, se aísla y purifica el vector binario. Luego, se puede introducir un gen extraño. El vector binario diseñado, incluido el gen extraño, se vuelve a introducir en E. coli para su amplificación.
El factor binario modificado se aísla de E. coli y se introduce en Agrobacteria que contiene un plásmido Ti modificado (relativamente pequeño). Esta Agrobacteria modificada se puede utilizar para infectar células vegetales. El ADN-T, que contiene el gen extraño, se integra en el genoma de la célula vegetal. En cada célula infectada, el ADN-T se integra en un sitio diferente del genoma.
La planta entera se regenerará a partir de una única célula transformada, dando como resultado un organismo con el ADN transformado integrado de forma idéntica en todas las células.
Se puede utilizar un gen selector para distinguir las células modificadas genéticamente de las no modificadas. El gen selector se integra en el plásmido junto con el gen diana deseado, lo que proporciona a las células resistencia a un antibiótico , como la kanamicina , la ampicilina , la espectinomicina o la tetraciclina . Las células deseadas, junto con cualquier otro organismo que crezca dentro del cultivo, se pueden tratar con un antibiótico, lo que permite que solo sobrevivan las células modificadas. El gen del antibiótico no suele transferirse a la célula vegetal, sino que permanece dentro de la célula bacteriana.
Los plásmidos se replican para producir muchas moléculas de plásmido en cada célula bacteriana huésped. El número de copias de cada plásmido en una célula bacteriana está determinado por el origen de replicación , que es la posición dentro de la molécula de plásmido donde se inicia la replicación del ADN. La mayoría de los vectores binarios tienen un mayor número de copias de plásmido cuando se replican en E. coli ; sin embargo, el número de copias del plásmido suele ser menor cuando el plásmido reside dentro de Agrobacterium tumefaciens . Los plásmidos también se pueden replicar utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El ADN-T contiene dos tipos de genes: los genes oncogénicos , que codifican enzimas implicadas en la síntesis de auxinas y citoquininas y responsables de la formación de tumores , y los genes que codifican la síntesis de opinas . Estos compuestos, producidos por la condensación entre aminoácidos y azúcares, son sintetizados y excretados por las células de la agalla de la corona, y son consumidos por A. tumefaciens como fuentes de carbono y nitrógeno.
Los genes implicados en el catabolismo de la opina , la transferencia de T-ADN de la bacteria a la célula vegetal y la transferencia conjugativa del plásmido bacteria-bacteria se encuentran fuera del T-ADN. [3] [4] El fragmento de T-ADN está flanqueado por repeticiones directas de 25 pb, que actúan como una señal del elemento cis para el aparato de transferencia. El proceso de transferencia de T-ADN está mediado por la acción cooperativa de proteínas codificadas por genes determinados en la región de virulencia del plásmido Ti (genes vir) y en el cromosoma bacteriano. El plásmido Ti también contiene los genes para el catabolismo de la opina producido por las células de la agalla de la corona y regiones para la transferencia conjugativa y para su propia integridad y estabilidad. La región de virulencia de 30 kb (vir) es un regulón organizado en seis operones esenciales para la transferencia de T-ADN (virA, virB, virD y virG) o para el aumento de la eficiencia de la transferencia (virC y virE). [3] [4] [5] Varios elementos genéticos determinados cromosómicamente han demostrado su papel funcional en la unión de A. tumefaciens a la célula vegetal y la colonización bacteriana. Los loci chvA y chvB están involucrados en la síntesis y excreción del b -1,2 glucano , [6] el chvE requerido para la mejora de azúcar de la inducción de genes vir y la quimiotaxis bacteriana . [7] [8] [9] El locus celular es responsable de la síntesis de fibrillas de celulosa . [10] El locus pscA (exoC) está involucrado en la síntesis tanto de glucano cíclico como de succinoglicano ácido . [11] [9] El locus att está involucrado en las proteínas de la superficie celular . [12]