La aminopeptidasa regulada por insulina (IRAP) es una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen de la leucil y cistinil aminopeptidasa ( LNPEP ) . IRAP es una proteína transmembrana de tipo II que pertenece a la subfamilia de las oxitocinasas de las aminopeptidasas M1 , junto con ERAP1 y ERAP2 . También se la conoce como oxitocinasa, leucil y cistinil aminopeptidasa, leucina aminopeptidasa placentaria (P-LAP), cistinil aminopeptidasa (CAP) y vasopresinasa. IRAP se expresa en diferentes tipos de células, principalmente ubicadas en endosomas regulados especializados que pueden reclutarse a la superficie celular tras la activación del receptor específico del tipo de célula.
Las funciones de la IRAP dependen del tipo de célula y del entorno extracelular. Por ejemplo, en los adipocitos y las células musculares , la IRAP es un componente principal de las vesículas de almacenamiento de Glut4 (GSV) y regula el tráfico de GSV en respuesta a la señalización del receptor de insulina . La alteración del reclutamiento de la IRAP en la superficie celular, como se observa en la diabetes tipo 2 , altera la captación de glucosa al bloquear el tráfico del transportador de glucosa tipo 4 (Glut4) en la membrana celular. Esta evidencia subraya una función central de la aminopeptidasa en esta enfermedad. [5]
La IRAP escinde varias hormonas, péptidos vasoactivos y neuropéptidos como la oxitocina , la somatostatina , la colecistoquinina , la angiotensina III (Ang), la lis-bradicinina , la arginina vasopresina , la Met- y Leu-encefalina , la neuroquinina A y la dinorfina A. [ 6] La mayoría de ellos tienen funciones primarias en el desarrollo de trastornos neurológicos, incluida la esquizofrenia y los trastornos de la memoria . [7] Además, una alteración en los niveles de neuropéptidos, debido a la desregulación de la IRAP, parece ser uno de los mecanismos que afectan los procesos de aprendizaje y cognición, destacando una función fundamental de la IRAP también en los trastornos de la memoria. [8]
En el cerebro, IRAP es el principal receptor de Ang IV, un componente esencial del sistema renina-angiotensina que ha demostrado tener un efecto neuroprotector. [9] [10] Esta evidencia ha impulsado la investigación sobre el desarrollo de análogos con alta selectividad de IRAP, que muestran potencial en la mejora de la memoria, la regulación vascular y los efectos anticonvulsivos/antiepileptogénicos. [11] [12] Estos análogos se estudiaron para enfermedades neurodegenerativas , demostrando una mejor estabilidad y penetración cerebral, una fuerte afinidad de unión a los receptores objetivo y efectos positivos en la función cognitiva y la neuroprotección en modelos animales. [13] También se ha descubierto que los inhibidores de IRAP contrarrestan la vasoconstricción inducida por acetilcolina in vivo , lo que destaca el papel de IRAP en la modulación de la función vascular. [14] La eliminación de IRAP reduce la susceptibilidad a las convulsiones inducidas por pentilentetrazol en ratones, lo que sugiere su potencial como objetivo terapéutico de la epilepsia.
IRAP desempeña un papel importante en la regulación del sistema inmunológico. De manera similar a ERAP1 y ERAP2, IRAP es capaz de recortar el extremo N-terminal de los péptidos antigénicos, reduciendo su longitud a 8-10 aminoácidos, la longitud óptima para la unión del MHC de clase I. A diferencia de ERAP1 y ERAP2, no hay evidencia de recorte mediado por IRAP de péptidos antigénicos en el retículo endoplásmico para la presentación del MHC-I a través de la vía directa. Por otro lado, IRAP tiene una función primaria en la presentación cruzada . Aquí, la aminopeptidasa recorta los péptidos presentados de forma cruzada en un compartimento endosómico específico, descrito en las células dendríticas , [15] antes de su carga en las moléculas del MHC de clase I asociadas a IRAP.
IRAP estabiliza el tipo particular de endosomas tempranos regulados en los que se encuentra. La estabilidad de estos endosomas es esencial para la vía de presentación cruzada en células dendríticas y regula varias vías de señalización endosómica ( TCR , TLR9 , TNFα , IL-6 ) en otros tipos de células inmunes. En las células T, IRAP regula el tráfico de cadenas TCD3ζ, que son reclutadas a vesículas intracelulares IRAP, así como la señalización endosómica por el complejo TCR. [16] El agotamiento de IRAP aumenta los niveles de TCR en la superficie celular que, sin embargo, muestran una señalización defectuosa. Otros estudios demostraron que IRAP regula la activación del receptor tipo Toll 9 (TLR9) al retrasar la maduración de los endosomas que contienen TLR9 a lisosomas y limitar, como consecuencia, la escisión y activación de TLR9. [17] Finalmente, la IRAP tiene un papel importante en la secreción de las citocinas proinflamatorias TNFα e IL-6 por los mastocitos . En ausencia de IRAP, el tráfico de vesículas que contienen TNFα e IL-6 desde el Golgi hasta la membrana plasmática se ve afectado. [18]
La IRAP está codificada por el gen LNPEP (leucil y cistinil aminopeptidasa), ubicado en el cromosoma 5q15. Este gen tiene una longitud de ~75 kb y consta de 18 exones y 17 intrones. [19] Según ensembl.org, LNPEP tiene 5 transcripciones pero solo una isoforma principal expresada (NM_005575.3).
Entre las diferentes variantes genéticas identificadas hasta ahora, varias variantes de un solo nucleótido se han asociado con enfermedades. La gran mayoría de las variantes de un solo nucleótido en LNPEP son variantes intrónicas que forman parte de un haplotipo extendido que funciona como potenciador transcripcional del gen adyacente ERAP2 pero no regula la expresión de LNPEP . De hecho, en comparación con los miembros de su familia de aminopeptidasas M1 ERAP1 y ERAP2, LNPEP muestra baja tolerancia a la variación genética que trunca proteínas y contiene pocas variantes de pérdida de función en su gen. [20]
LNPEP tiene cinco variantes sin sentido comunes (>1% en GnomAD) , de las cuales la más común, rs2303138, que conduce a una sustitución de aminoácidos (Ala763Thr), se ha relacionado con el riesgo de psoriasis y espondilitis anquilosante . [21] [22] El papel preciso de IRAP en estas afecciones sigue siendo desconocido, pero dada su participación en la activación de las respuestas inmunes adaptativas e innatas, el sistema renina-angiotensina (RAS) y el metabolismo de la glucosa, estas variantes genéticas pueden tener impactos pleiotrópicos en los sistemas inmunológico, circulatorio y metabólico. [23] Otras dos variantes sin sentido comunes, rs41276279 (p.Val373Ile) y rs11746232 (p.Ile963Val), se correlacionan moderadamente con los niveles de expresión del gen LNPEP (referencia a gtexportal.org), pero hasta ahora no se han relacionado con la enfermedad.
El gen humano IRAP codifica una proteína transmembrana de tipo II que consta de tres dominios distintos: un dominio citoplasmático N-terminal que contiene 109 aminoácidos, un dominio transmembrana de 23 aminoácidos y un dominio intraluminal (o extracelular) compuesto por 893 aminoácidos. [24] El dominio intraendosomal C-terminal alberga el motivo de unión a Zn conocido como HEXXH(X)18E, así como el motivo de exopeptidasa GAMEN. Estos dos motivos también están presentes en ERAP1 y ERAP2 y son compartidos entre todos los miembros de la familia M1 de aminopeptidasas. El dominio C-terminal se ha cristalizado como un dímero, cada monómero consta de cuatro dominios continuos y forma una estructura hueca cerrada con el sitio activo en su centro. El dominio I (residuos 171–365) forma un extenso sándwich β con una silla de montar β de siete cadenas flanqueada a cada lado por láminas β de tres y cuatro cadenas. El dominio II (residuos 366–615) contiene el sitio catalítico con un ion Zn en su centro. El ion Zn catalítico está coordinado por His464, His468 y Glu487 del motivo de unión al cinc HEXXH(X)18-E. El dominio III (residuos 616–704) adopta un pliegue sándwich β que consta de láminas β de tres y cuatro cadenas y forma un puente entre los dominios II y IV. El dominio IV (residuos 705–1025) consta de hélices α y se ensambla en forma de “cuenco”. El sitio activo de IRAP está cubierto por el dominio IV para formar una cavidad grande, mayormente cerrada, adyacente al ion Zn. [25]
IRAP1 utiliza un mecanismo catalítico como el propuesto para la hidrolasa LTA4. Adopta un pliegue similar a la termolisina y se ha cristalizado en dos conformaciones distintas, una abierta y otra cerrada (Figura 1). [25] [26] IRAP es la única aminopeptidasa M1 documentada que puede escindir péptidos cíclicos como la vasopresina y la oxitocina. La configuración distintiva del motivo GAMEN en IRAP genera espacio adicional alrededor de los residuos 3 y 4 del péptido lineal unido, que podría usarse para la acomodación de cadenas laterales más voluminosas, posiblemente proporcionando una selectividad más amplia para los péptidos. [26] Las interacciones atómicas entre un ligando e IRAP pueden promover el cierre conformacional. La conformación abierta es responsable de la captura inicial del sustrato, que puede inducir un cierre adicional que mejora las interacciones y facilita la catálisis. La estructura IRAP/ligando unido tiene diferencias significativas en comparación con la estructura “abierta” y la estructura IRAP/péptido. [27] Se encontró que el dominio IV estaba yuxtapuesto a los dominios I/II, lo que resultó en la exclusión total de la cavidad interna del solvente externo. Recientemente, se resolvió la estructura cristalina de IRAP con un inhibidor de péptido macrocíclico, lo que identificó varias características clave del mecanismo de inhibición. La yuxtaposición cercana del bucle GAMEN en el inhibidor unido no deja espacio para que el movimiento de las moléculas de agua interactúe con el carboxilato ionizado del residuo del sitio activo Glu (Glu465). Se propuso una sinergia de dos mecanismos, la estabilización de la conformación cerrada y la exclusión del agua catalítica por el bucle GAMEN estrechamente yuxtapuesto como mecanismo de inhibición. [28] Además, las aminopeptidasas M1 utilizan un residuo de tirosina en el sitio activo para estabilizar el estado de transición. En el caso de IRAP, el Tyr549 catalítico se encuentra en diferentes orientaciones en las conformaciones abierta y cerrada. Por ejemplo, en el caso de los inhibidores de pseudopéptidos fosfínicos, que imitan el estado de transición de los sustratos peptídicos, Tyr549 cambia de orientación al unirse al ligando para interactuar con uno de los átomos de oxígeno del grupo fosfínico, que es equivalente a los átomos de oxígeno del sustrato en el estado de transición. [26]
Se ha informado que IRAP interactúa a través de su dominio citoplasmático con varias proteínas involucradas en el tráfico vesicular, la fijación de orgánulos y la remodelación del citoesqueleto. Estas proteínas incluyen tankyrase-1 , tankyrase-2 y p115, que regulan el tráfico de vesículas de Golgi; vimentina, un filamento intermedio del citoesqueleto; y la proteína remodeladora de actina FHOS. Además, se encontró que IRAP se asociaba con AS160/Tbc1d4 , una proteína activadora de GTPasa Rab (GAP) específica para Rab8 , 10 y 14. Esto sugiere que IRAP desempeña un papel en el reclutamiento de AS160 a las membranas endocíticas. [29]
Aparte de su asociación con proteínas de tráfico intracelular, también se ha observado que IRAP interactúa con proteínas presentes en vesículas de almacenamiento Glut4 (GSV), como sortilina , LRP1 y Glut4 en adipocitos . En condiciones inflamatorias, su papel en el tráfico de GSV en adipocitos está regulado por la proteína TNFa a través de la glicosilación. [29] Recientemente, se descubrió su interacción con la cadena z del TCR (receptor de células T) y la quinasa Lck en linfocitos T. [16] En células dendríticas, el tráfico de vesículas dependiente de IRAP y la translocación a la copa fagocítica está regulado por receptores inmunes, como TLR4 y FcgR. Finalmente, se ha propuesto que IRAP interactúa con complejos mayores de histocompatibilidad clase I (MHC-I) en endosomas especializados en DC. Allí exhibe roles en la presentación cruzada de antígenos. [15]
Los enfoques terapéuticos para la regulación de IRAP se basan en el desarrollo de peptidomiméticos e inhibidores de moléculas pequeñas. Las clases de inhibidores de IRAP más exploradas son los de sitio catalítico o alostérico.
Los primeros inhibidores de IRAP reportados fueron diseñados como análogos de angiotensina IV (AngIV). [30] En 2006, Axén et al publicaron una versión macrociclada de un derivado de AngIV (Compuesto 1) que confiere estabilidad metabólica junto con alta afinidad por IRAP ( K i = 25,8 nM). [31] Bajo un alcance similar, Lukaszuk et al produjeron el compuesto AL-11 , que fue capaz de inhibir IRAP ( K i = 27,5 nM) y mostró una selectividad de alrededor de 200 veces sobre APN. [32] Otras modificaciones estructurales en los inhibidores basados en AngIV de Anderson et al condujeron al macrociclo optimizado HA08 (estructura cristalina disponible dentro de IRAP, Figura 2 [28] ) con excelente potencia de IRAP ( K i = 3,3 nM) y selectividad sobre APN, pero mala estabilidad metabólica. [33]
Los compuestos basados en benzopirano se identificaron en una prueba virtual contra IRAP en 2008 e interactúan con el catión zinc del sitio catalítico. [33] Todos los compuestos mostraron especificidad hacia IRAP contra las otras aminopeptidasas con una afinidad nanomolar, mientras que HFI-419 mostró la mayor potencia (Ki = 0,48 μM) y también se probó en bioensayos in vivo de la función de la memoria. [34]
Aunque la mayoría de los análogos de pseudopéptidos fosfínicos revelados por Kokkala et al en 2016 eran inhibidores de ERAP no selectivos, DG026 mostró una afinidad nanomolar hacia IRAP (IC 50 = 32 nM) con selectividad mejorada. [35]
Se diseñó racionalmente una nueva familia de compuestos de ácido diaminobenzoico (DABA) dirigidos al zinc que contienen fracciones de aminoácidos naturales y no naturales, con potencia micromolar para IRAP (compuesto 6, IC50 = 2,1 μM) y selectividad moderada sobre ERAP1 y ERAP2. [35] [36]
En 2014, Vanga et al. reconocieron la capacidad de las arilsulfonamidas para inhibir la IRAP después de examinar una biblioteca de 10 500 compuestos similares a fármacos. Después de una mayor optimización, se desarrolló el compuesto 7 que muestra una afinidad micromolar hacia la IRAP (CI 50 = 0,8 μM). [37]
Se han descrito inhibidores selectivos de bajo nanomolar de IRAP basados en el armazón α-hidroxi-β-amino del fármaco Ubenimex (Bestatin), que muestran una excelente selectividad y una fuerte actividad celular en el bloqueo de la presentación cruzada. [38]
Durante un proceso de selección en 2016, se identificó un compuesto de dihidroquinazolina espiro-oxindol como uno de los inhibidores más potentes de IRAP. Este tipo de compuestos muestra una alta especificidad de IRAP contra APN (IC50 del compuesto 8 = 5,8 μM) y, según los estudios de acoplamiento, el inhibidor actúa en un bolsillo de unión cerca del bucle GAMEN sin interactuar con el átomo zing, lo que conduce a una inhibición no competitiva, confirmada posteriormente por estudios cinéticos. [39]
