Las tecnologías de recombinasa de sitio específico son herramientas de ingeniería genómica que dependen de enzimas recombinasas para reemplazar secciones específicas de ADN.
A finales de la década de 1980, la selección de genes en células madre embrionarias (ESC) murinas permitió la transmisión de mutaciones a la línea germinal del ratón y surgió como una opción novedosa para estudiar las bases genéticas de las redes reguladoras tal como existen en el genoma. Aún así, la selección clásica de genes demostró estar limitada de varias maneras, ya que las funciones genéticas fueron destruidas irreversiblemente por el gen marcador que tuvo que introducirse para seleccionar ESC recombinantes. Estos primeros pasos dieron lugar a animales en los que la mutación estaba presente en todas las células del cuerpo desde el principio, dando lugar a fenotipos complejos y/o letalidad temprana. Había una clara necesidad de métodos para restringir estas mutaciones a puntos específicos del desarrollo y tipos de células específicos. Este sueño se hizo realidad cuando grupos de Estados Unidos lograron introducir sistemas de recombinación de sitio específico (SSR) derivados de bacteriófagos y levaduras en células de mamíferos y en ratones. [1] [2] [3]
Las estrategias comunes de ingeniería genética requieren una modificación permanente del genoma objetivo. Para ello es necesario invertir gran sofisticación en el diseño de rutas aplicadas para la entrega de transgenes. Aunque para fines biotecnológicos la integración aleatoria sigue siendo común, puede dar lugar a una expresión genética impredecible debido al número variable de copias de transgenes, la falta de control sobre los sitios de integración y las mutaciones asociadas. Los requisitos moleculares en el campo de las células madre son mucho más estrictos. Aquí, la recombinación homóloga (HR) puede, en principio, proporcionar especificidad al proceso de integración, pero para los eucariotas se ve comprometida por una eficiencia extremadamente baja. Aunque las meganucleasas, las nucleasas efectoras similares a los activadores de la transcripción y los dedos de zinc (ZFN y TALEN) son herramientas reales que respaldan la HR, fue la disponibilidad de recombinasas específicas de sitio (SSR) lo que desencadenó la construcción racional de líneas celulares con propiedades predecibles. Hoy en día, ambas tecnologías, HR y SSR, se pueden combinar en "tecnologías de etiqueta e intercambio" altamente eficientes. [4]
Se han identificado muchos sistemas de recombinación de sitio específico para realizar estos reordenamientos de ADN para una variedad de propósitos, pero casi todos pertenecen a cualquiera de dos familias, tirosina recombinasas (YR) y serina recombinasas (SR), dependiendo de su mecanismo . Estas dos familias pueden mediar hasta tres tipos de reordenamientos del ADN (integración, escisión/resolución e inversión) a lo largo de diferentes rutas de reacción según su origen y arquitectura. [5]
El miembro fundador de la familia YR es la lambda integrasa, codificada por el bacteriófago λ , que permite la integración del ADN del fago en el genoma bacteriano. Una característica común de esta clase es un nucleófilo de tirosina conservado que ataca al ADN-fosfato escindible para formar un enlace 3'-fosfotirosina. Los primeros miembros de la familia SR están estrechamente relacionados con resolvasas/ADN invertasas de los transposones bacterianos Tn3 y γδ, que dependen de una serina catalítica responsable de atacar el fosfato escindible para formar un enlace 5'-fosfoserina. Estos hechos indiscutibles, sin embargo, se vieron comprometidos por una gran confusión en el momento en que otros miembros entraron en escena, por ejemplo las recombinasas YR Cre y Flp (capaces de integración, escisión/resolución así como de inversión), que sin embargo fueron bien recibidas como nuevos miembros de la "familia integrasa". Los ejemplos opuestos son PhiC31 y SR relacionados, que se introdujeron originalmente como resolvasa/invertasas aunque, en ausencia de factores auxiliares, la integración es su única función. Hoy en día la actividad estándar de cada enzima determina su clasificación reservándose el término general "recombinasa" para miembros de la familia que, per se, comprenden las tres rutas, INT, RES e INV:
Nuestra tabla amplía la selección de los sistemas SSR convencionales y los agrupa según su rendimiento. Todas estas enzimas recombinan dos sitios diana, que son idénticos (subfamilia A1) o distintos (enzimas derivadas de fagos en A2, B1 y B2). [6] Mientras que para A1 estos sitios tienen designaciones individuales (" FRT " en el caso de la recombinasa Flp, loxP para la recombinasa Cre), los términos " att P" y " att B" (sitios de unión en la parte fago y bacteriana, respectivamente) son válidos en los demás casos. En el caso de la subfamilia A1, tenemos que tratar con sitios cortos (generalmente de 34 pb) que constan de dos brazos (casi) idénticos de 13 pb (flechas) que flanquean un espaciador de 8 pb (la región de cruce, indicada por dobletes de líneas rojas). [7] Tenga en cuenta que para Flp existe un sitio alternativo de 48 pb disponible con tres brazos, cada uno con capacidad para una unidad Flp (el llamado "protómero"). Los sitios att P y att B siguen reglas arquitectónicas similares, pero aquí los brazos muestran solo una identidad parcial (indicada por las líneas discontinuas) y difieren en ambos casos. Estas características explican diferencias relevantes:
Para simplificar este capítulo, las siguientes implementaciones se centrarán en dos recombinasas (Flp y Cre) y solo una integrasa (PhiC31), ya que su espectro cubre las herramientas que, en la actualidad, se utilizan principalmente para modificaciones dirigidas del genoma. Esto se hará en el marco del siguiente resumen.
El modo de integración/resolución e inversión (INT/RES e INV) dependen de la orientación de los sitios objetivo de la recombinasa (RTS), entre estos pares de att P y att B. La sección C indica, de manera simplificada, la forma mediada por recombinasa El intercambio de casetes (RMCE) se puede lograr mediante cruces recíprocos dobles sincrónicos (en lugar de integración, seguida de resolución). [8] [9]
Las Tyr-Recombinasas son reversibles, mientras que la Ser-Integrase es unidireccional. Es de destacar la forma en que la integración/resolución reversible de Flp (una recombinasa Tyr) es modulada por versiones FRT de 48 pb (en lugar de un mínimo de 34 pb) : el brazo adicional de 13 pb sirve como una "ruta de aterrizaje" de Flp que contribuye a la formación del complejo sináptico, tanto en el contexto de las funciones Flp-INT como Flp-RMCE (ver las respectivas situaciones de equilibrio). Si bien es apenas posible evitar la reversión de la integración (impulsada por la entropía) en la sección A para Cre y difícil de lograr para Flp, la RMCE se puede completar si el plásmido donante se proporciona en exceso debido al carácter bimolecular tanto de la fase directa como de la integración. - y la reacción inversa. Colocar ambos sitios FRT de manera inversa conducirá a un equilibrio de ambas orientaciones para el inserto (flecha verde). A diferencia de Flp, la integrasa Ser PhiC31 (representaciones inferiores) conduce a una integración unidireccional, al menos en ausencia de un factor de direccionalidad de recombinasa (RDF-). [10] En relación con Flp-RMCE, que requiere dos mutantes espaciadores FRT diferentes ("heteroespecíficos") , el compañero de reacción ( att B) del primer sitio att P que reacciona se golpea arbitrariamente, de modo que no hay control sobre la dirección. el casete del donante entra en el objetivo (cf. los productos alternativos). También a diferencia de Flp-RMCE , varios objetivos RMCE distintos no se pueden montar en paralelo, debido a la falta de combinaciones att P/ att B heteroespecíficas (sin interacción cruzada).
La Cre recombinasa (Cre) es capaz de recombinar secuencias específicas de ADN sin necesidad de cofactores . La enzima reconoce secuencias de ADN de 34 pares de bases denominadas loxP ("lugar de cruce en el fago P1"). Dependiendo de la orientación de los sitios objetivo entre sí, Cre integrará/escindirá o invertirá secuencias de ADN. Tras la escisión (llamada "resolución" en el caso de un sustrato circular) de una región particular del ADN, la expresión genética normal se ve considerablemente comprometida o terminada. [11]
Debido a la pronunciada actividad de resolución de Cre, una de sus aplicaciones iniciales fue la escisión de genes flanqueados por lox P ("floxed") que conducen a la eliminación genética específica de la célula de dicho gen floxed después de que Cre se expresa en el tejido de interés. Las tecnologías actuales incorporan métodos que permiten el control tanto espacial como temporal de la actividad del Cre. Un método común que facilita el control espacial de la alteración genética implica la selección de un promotor específico de tejido para impulsar la expresión de Cre. La colocación de Cre bajo el control de dicho promotor da como resultado una expresión localizada y específica de tejido. Por ejemplo, Leone et al. han colocado la unidad de transcripción bajo el control de las secuencias reguladoras del gen de la proteína proteolípida de mielina (PLP), lo que lleva a la eliminación inducida de secuencias genéticas específicas en oligodendrocitos y células de Schwann . [12] El fragmento de ADN específico reconocido por Cre permanece intacto en las células que no expresan el gen PLP; esto a su vez facilita la observación empírica de los efectos localizados de las alteraciones del genoma en la vaina de mielina que rodea las fibras nerviosas en el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP). [13] La expresión selectiva de Cre también se ha logrado en muchos otros tipos de células y tejidos.
Para controlar la actividad temporal de la reacción de escisión, se han desarrollado formas de Cre que aprovechan diversos dominios de unión a ligando . Una estrategia exitosa para inducir la actividad temporal específica de Cre implica fusionar la enzima con un dominio de unión a ligando mutado para el receptor de estrógeno humano (ERt). Tras la introducción de tamoxifeno (un antagonista del receptor de estrógeno ), la construcción Cre-ERt puede penetrar el núcleo e inducir una mutación dirigida. ERt se une al tamoxifeno con mayor afinidad que los estrógenos endógenos , lo que permite que Cre-ERt permanezca citoplasmático en animales no tratados con tamoxifeno. El control temporal de la actividad SSR por parte del tamoxifeno permite que se induzcan cambios genéticos más adelante en la embriogénesis y/o en los tejidos adultos. [12] Esto permite a los investigadores evitar la letalidad embrionaria mientras siguen investigando la función de los genes específicos.
Ampliaciones recientes de estos conceptos generales llevaron a generar el "Cre-zoo", es decir, colecciones de cientos de cepas de ratón para las cuales se pueden eliminar genes definidos mediante la expresión específica de Cre. [3]
En su huésped natural (S. cerevisiae), el sistema Flp/ FRT permite la replicación de un "plásmido de 2 μ" mediante la inversión de un segmento que está flanqueado por dos sitios FRT idénticos, pero orientados de manera opuesta (actividad "flipasa"). Esta inversión cambia la orientación relativa de las horquillas de replicación dentro del plásmido, lo que permite un "círculo rodante": la amplificación de la entidad circular de 2 μ antes de que los intermedios multiméricos se resuelvan para liberar múltiples productos monoméricos. Mientras que los sitios FRT mínimos de 34 pb favorecen la escisión/resolución en un grado similar a los sitios análogos lox P para Cre, las variantes naturales y más extendidas de FRT de 48 pb permiten un mayor grado de integración, al tiempo que superan ciertas interacciones promiscuas como se describe para enzimas de fagos como Cre- [5] y PhiC31. [6] Una ventaja adicional es el hecho de que se pueden aplicar reglas simples para generar sitios FRT heteroespecíficos que se cruzan con socios iguales pero no con FRT de tipo salvaje . Estos hechos han permitido, desde 1994, el desarrollo y perfeccionamiento continuo de estrategias de intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) que permiten el intercambio limpio de un casete objetivo por un casete donante entrante. [6]
Basado en la tecnología RMCE, en el marco del programa EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis), se ha desarrollado un recurso particular de cepas ES precaracterizadas que se presta a una mayor elaboración, basado en los ya establecidos Cre- y/o Flp-. configuraciones basadas en "FlExing" (escisión/inversión mediada por FLP), [6] que involucran las actividades de escisión e inversión. Iniciado en 2005, este proyecto se centró primero en la mutagénesis de saturación para permitir una anotación funcional completa del genoma del ratón (coordinado por el Consorcio Internacional Knockout-Mouse, IKMC) con el objetivo final de mutar todos los genes de proteínas mediante captura y orientación de genes en animales murinos. Células ES. [14] Estos esfuerzos marcan la cima de varias estrategias de "etiquetar e intercambiar", que se dedican a etiquetar un sitio genómico distinto de modo que la "etiqueta" pueda servir como una dirección para introducir información genética novedosa (o alterar la existente). El paso de etiquetado per se puede abordar ciertas clases de sitios de integración explotando las preferencias de integración de retrovirus o incluso integrasas específicas de sitio como PhiC31, las cuales actúan de manera esencialmente unidireccional.
Los tradicionales y laboriosos procedimientos de "etiqueta e intercambio" se basaban en dos pasos sucesivos de recombinación homóloga (HR-), el primero ("HR1") para introducir una etiqueta que consta de un gen marcador de selección. Luego se usó "HR2" para reemplazar el marcador por el "GOI". En la primera reacción ("knock-out"), el gen se marcó con un marcador seleccionable, típicamente mediante la inserción de un casete hygtk ([+/-]). proporcionando resistencia a G418 En la siguiente etapa de activación, la secuencia genómica marcada se reemplazó por secuencias genómicas homólogas con ciertas mutaciones y luego se pudieron aislar clones celulares por su resistencia al ganciclovir debido a la pérdida del gen HSV-tk. ("selección negativa"). Este procedimiento convencional de etiquetado e intercambio de dos pasos [15] podría simplificarse después de la llegada de RMCE, que podría asumir el control y agregar eficiencia al paso de activación.
Sin mucha duda, las integrasas Ser son las herramientas de elección actuales para integrar transgenes en un número restringido de sitios aceptores genómicos bien comprendidos que en su mayoría (pero no siempre) imitan el sitio att P del fago en el sentido de que atraen un vector donante que contiene att B. . En este momento, el miembro más destacado es PhiC31-INT con potencial probado en el contexto de genomas humanos y de ratón.
A diferencia de las recombinasas Tyr anteriores, PhiC31-INT como tal actúa de manera unidireccional, fijando firmemente el vector donante en un objetivo anclado genómicamente. Una ventaja obvia de este sistema es que puede depender de sitios donantes de att P (aceptor) y att B nativos no modificados. Pueden surgir beneficios adicionales (junto con ciertas complicaciones) del hecho de que los genomas humanos y de ratón contienen per se un número limitado de objetivos endógenos (los llamados " pseudositios att P"). La información disponible sugiere que los considerables requisitos de secuencia de ADN permiten que la integrasa reconozca menos sitios que los sistemas de integración retrovirales o incluso basados en transposasa, lo que abre su carrera como vehículo portador superior para el transporte y la inserción en una serie de sitios genómicos bien establecidos, algunos de los cuales con tanta llamadas propiedades de "puerto seguro". [10]
Aprovechando el hecho de que existen rutas de recombinación específicas ( att P x att B), RMCE se vuelve posible sin requisitos de sitios att heteroespecíficos sintéticos . Sin embargo, esta ventaja obvia viene a expensas de ciertas deficiencias, como la falta de control sobre el tipo o la direccionalidad del casete entrante (donante). [6] Se imponen restricciones adicionales por el hecho de que la irreversibilidad no permite configuraciones RMCE de multiplexación estándar que incluyan reacciones "RMCE en serie", es decir, intercambios repetidos de casetes en un locus genómico determinado .
La anotación de los genomas humanos y de ratón ha llevado a la identificación de >20 000 genes codificadores de proteínas y >3 000 genes de ARN no codificantes, que guían el desarrollo del organismo desde la fertilización hasta la embriogénesis y la vida adulta. Aunque se observan avances espectaculares, la relevancia de las variantes genéticas raras sigue siendo un tema central de investigación.
Como una de las plataformas más importantes para abordar las funciones genéticas de vertebrados a gran escala, se han establecido recursos genéticos de todo el genoma de células ES murinas mutantes. Con este fin, se han fundado en Europa y América del Norte cuatro programas internacionales destinados a la mutagénesis de saturación del genoma del ratón (EUCOMM, KOMP, NorCOMM y TIGM). Coordinados por el Consorcio Internacional de Ratones Knockout (IKSC), estos depósitos de células ES están disponibles para el intercambio entre unidades de investigación internacionales. Los recursos actuales comprenden mutaciones en 11.539 genes únicos, 4.414 de ellos condicionales. [14]
Las tecnologías pertinentes han alcanzado ahora un nivel que permite su extensión a otras especies de mamíferos y a células madre humanas, sobre todo aquellas con un estatus iPS (pluripotente inducido) .