La unión de extremos no homólogos ( NHEJ ) es una vía que repara las roturas de doble cadena en el ADN. Se denomina "no homóloga" porque los extremos rotos se ligan directamente sin necesidad de una plantilla homóloga, a diferencia de la reparación dirigida por homología (HDR), que requiere una secuencia homóloga para guiar la reparación. NHEJ está activo tanto en células que no se dividen como en células que proliferan, mientras que HDR no es fácilmente accesible en células que no se dividen. [1] El término "unión de extremos no homólogos" fue acuñado en 1996 por Moore y Haber. [2]
NHEJ normalmente se guía por secuencias cortas de ADN homólogas llamadas microhomologías. Estas microhomologías suelen estar presentes en salientes monocatenarios en los extremos de roturas de doble hebra. Cuando los voladizos son perfectamente compatibles, NHEJ suele reparar la rotura con precisión. [2] [3] [4] [5] También puede ocurrir una reparación imprecisa que conduce a la pérdida de nucleótidos, pero es mucho más común cuando los salientes no son compatibles. Una NHEJ inadecuada puede provocar translocaciones y fusión de telómeros , características distintivas de las células tumorales . [6]
Se entiende que las implementaciones de NHEJ han existido en casi todos los sistemas biológicos y es la vía predominante de reparación de roturas de doble hebra en células de mamíferos. [7] Sin embargo, en la levadura en ciernes ( Saccharomyces cerevisiae ), la recombinación homóloga domina cuando el organismo se cultiva en condiciones comunes de laboratorio.
Cuando la vía NHEJ está inactiva, las roturas de doble cadena se pueden reparar mediante una vía más propensa a errores llamada unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ). En esta vía, la resección final revela microhomologías cortas a cada lado de la rotura, que luego se alinean para guiar la reparación. [8] Esto contrasta con el NHEJ clásico, que normalmente utiliza microhomologías ya expuestas en salientes monocatenarios en los extremos del DSB. Por lo tanto, la reparación mediante MMEJ conduce a la eliminación de la secuencia de ADN entre las microhomologías.
Muchas especies de bacterias, incluida Escherichia coli , carecen de una vía de unión de extremos y, por lo tanto, dependen completamente de la recombinación homóloga para reparar las roturas de la doble hebra. Las proteínas NHEJ se han identificado en varias bacterias, incluidas Bacillus subtilis , Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium smegmatis . [9] [10] Las bacterias utilizan una versión notablemente compacta de NHEJ en la que todas las actividades requeridas están contenidas en solo dos proteínas: un homodímero Ku y la ligasa/polimerasa/nucleasa multifuncional LigD . [11] En las micobacterias, NHEJ es mucho más propenso a errores que en la levadura, y a menudo se agregan y eliminan bases de los extremos de las roturas de doble cadena durante la reparación. [10] Muchas de las bacterias que poseen proteínas NHEJ pasan una parte importante de su ciclo de vida en una fase haploide estacionaria, en la que no hay disponible una plantilla para la recombinación. [9] NHEJ puede haber evolucionado para ayudar a estos organismos a sobrevivir a los DSB inducidos durante la desecación. Utiliza preferentemente rNTP (nucleótidos de ARN), posiblemente ventajosos en células inactivas. [12]
El sistema arqueal NHEJ en Methanocella paludicola tiene un Ku homodimérico, pero las tres funciones de LigD se dividen en tres proteínas de dominio único que comparten un operón. Los tres genes conservan una homología sustancial con sus homólogos LigD y la polimerasa conserva la preferencia por rNTP. [13] NHEJ se ha perdido y adquirido varias veces en bacterias y arqueas, con una cantidad significativa de transferencia horizontal de genes barajando el sistema entre taxones. [14]
Corndog y Omega, dos micobacteriófagos relacionados de Mycobacterium smegmatis , también codifican homólogos de Ku y explotan la vía NHEJ para recircularizar sus genomas durante la infección. [15] A diferencia de la recombinación homóloga, que se ha estudiado ampliamente en bacterias, NHEJ se descubrió originalmente en eucariotas y solo se identificó en procariotas en la última década.
A diferencia de las bacterias, NHEJ en eucariotas utiliza una serie de proteínas que participan en los siguientes pasos:
En la levadura, el complejo Mre11-Rad50-Xrs2 ( MRX ) se recluta temprano en los DSB y se cree que promueve la unión de los extremos del ADN. [16] El correspondiente complejo de mamíferos de Mre11-Rad50- Nbs1 ( MRN ) también está involucrado en NHEJ, pero puede funcionar en múltiples pasos de la vía más allá de simplemente mantener los extremos cerca. [17] También se cree que DNA-PKcs participa en la formación de puentes terminales durante la NHEJ de los mamíferos. [18]
El Ku eucariota es un heterodímero que consta de Ku70 y Ku80 y forma un complejo con ADN-PKcs, que está presente en los mamíferos pero ausente en las levaduras . Ku es una molécula en forma de cesta que se desliza sobre el extremo del ADN y se traslada hacia adentro. Ku puede funcionar como un sitio de acoplamiento para otras proteínas NHEJ y se sabe que interactúa con el complejo ADN ligasa IV y XLF . [19] [20]
El procesamiento final implica la eliminación de nucleótidos dañados o no coincidentes mediante nucleasas y la resíntesis mediante ADN polimerasas. Este paso no es necesario si los extremos ya son compatibles y tienen extremos 3' hidroxilo y 5' fosfato.
Se sabe poco sobre la función de las nucleasas en NHEJ. Artemisa es necesaria para abrir las horquillas que se forman en los extremos del ADN durante la recombinación V(D)J , un tipo específico de NHEJ, y también puede participar en el recorte de los extremos durante el NHEJ general. [21] Mre11 tiene actividad nucleasa, pero parece estar involucrado en la recombinación homóloga , no en NHEJ.
Las ADN polimerasas de la familia X, Pol λ y Pol μ (Pol4 en levadura ), llenan los vacíos durante NHEJ. [4] [22] [23] Las levaduras que carecen de Pol4 no pueden unirse a salientes de 3' que requieren relleno de huecos, pero siguen siendo competentes para rellenar huecos en salientes de 5'. [24] Esto se debe a que el extremo del cebador utilizado para iniciar la síntesis de ADN es menos estable en los salientes 3', lo que requiere una polimerasa NHEJ especializada.
El complejo ADN ligasa IV, que consta de la subunidad catalítica ADN ligasa IV y su cofactor XRCC4 (Dnl4 y Lif1 en levadura), realiza el paso de ligación de reparación. [25] XLF , también conocido como Cernunnos, es homólogo de la levadura Nej1 y también es necesario para NHEJ. [26] [27] Si bien se desconoce el papel preciso de XLF , interactúa con el complejo XRCC4/ADN ligasa IV y probablemente participa en el paso de ligadura. [28] La evidencia reciente sugiere que XLF promueve la readenilación de la ADN ligasa IV después de la ligadura, recargando la ligasa y permitiéndole catalizar una segunda ligadura. [29]
En la levadura, Sir2 se identificó originalmente como una proteína NHEJ, pero ahora se sabe que es necesaria para NHEJ solo porque es necesaria para la transcripción de Nej1. [30]
NHEJ y sitios termolábiles
La inducción de sitios termolábiles (HLS) es una característica de la radiación ionizante. Los sitios de daño agrupados en el ADN constan de diferentes tipos de lesiones del ADN. Algunas de estas lesiones no son DSB inmediatas, pero se convierten en DSB después del calentamiento. Los HLS no evolucionan a DSB a temperatura fisiológica (370 C). Además, la interacción del HLS con otras lesiones y su papel en las células vivas aún es difícil de alcanzar. Los mecanismos de reparación de estos sitios no se revelan completamente. La NHEJ es la vía de reparación del ADN dominante durante todo el ciclo celular. La proteína DNA-PKcs es el elemento crítico en el centro de NHEJ. El uso de líneas celulares DNA-PKcs KO o la inhibición de DNA-PKcs no afecta la capacidad de reparación de HLS. Además, el bloqueo de las vías de reparación de HR y NHEJ mediante el inhibidor de dactolisib (NVP-BEZ235) demostró que la reparación de HLS no depende de HR y NHEJ. Estos resultados mostraron que el mecanismo de reparación de HLS es independiente de las vías NHEJ y HR [31]
La elección entre NHEJ y la recombinación homóloga para la reparación de una rotura de doble hebra se regula en el paso inicial de la recombinación, la resección del extremo 5'. En este paso, las nucleasas degradan la hebra 5' de la rotura para crear largas colas monocatenarias 3'. NHEJ puede volver a unir los DSB que no han sido resecados, pero la resección incluso de unos pocos nucleótidos inhibe fuertemente el NHEJ y compromete efectivamente la ruptura para reparar mediante recombinación. [23] NHEJ está activo durante todo el ciclo celular, pero es más importante durante G1 cuando no hay una plantilla homóloga disponible para la recombinación. Esta regulación se logra mediante la quinasa Cdk1 dependiente de ciclina ( Cdc28 en levadura), que se desactiva en G1 y se expresa en S y G2 . Cdk1 fosforila la nucleasa Sae2, lo que permite que se inicie la resección. [32]
NHEJ desempeña un papel fundamental en la recombinación V(D)J , el proceso mediante el cual se genera diversidad de receptores de células B y T en el sistema inmunológico de los vertebrados . [33] En la recombinación V(D)J, la nucleasa RAG1/RAG2 crea roturas de doble cadena rematadas en horquilla , que escinde el ADN en secuencias señal de recombinación. [34] Estas horquillas son luego abiertas por la nucleasa Artemisa y unidas por NHEJ. [21] Una ADN polimerasa especializada llamada desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que solo se expresa en el tejido linfático, agrega nucleótidos sin plantilla a los extremos antes de que se una la rotura. [35] [36] Este proceso acopla regiones "variables" (V), "diversidad" (D) y "unión" (J), que cuando se ensamblan crean la región variable de un receptor de células B o T. gene. A diferencia del NHEJ celular típico, en el que la reparación precisa es el resultado más favorable, la reparación propensa a errores en la recombinación V(D)J es beneficiosa porque maximiza la diversidad en la secuencia codificante de estos genes. Los pacientes con mutaciones en los genes NHEJ no pueden producir células B y células T funcionales y padecen inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
Los telómeros normalmente están protegidos por una "tapa" que impide que se reconozcan como roturas de doble hebra. La pérdida de proteínas protectoras provoca un acortamiento de los telómeros y una unión inadecuada por parte de NHEJ, lo que produce cromosomas dicéntricos que luego se separan durante la mitosis. Paradójicamente, algunas proteínas NHEJ participan en la protección de los telómeros. Por ejemplo, Ku se localiza en los telómeros y su eliminación conduce a telómeros acortados. [37] Ku también es necesario para el silenciamiento subtelomérico, el proceso mediante el cual se desactivan los genes ubicados cerca de los telómeros.
Varios síndromes humanos están asociados con NHEJ disfuncional. [38] Las mutaciones hipomórficas en LIG4 y XLF causan el síndrome LIG4 y XLF-SCID, respectivamente. Estos síndromes comparten muchas características, incluida la radiosensibilidad celular, la microcefalia y la inmunodeficiencia combinada grave (SCID) debido a una recombinación defectuosa de V(D)J . Las mutaciones con pérdida de función en Artemisa también causan SCID, pero estos pacientes no muestran los defectos neurológicos asociados con las mutaciones LIG4 o XLF. La diferencia de gravedad puede explicarse por las funciones de las proteínas mutadas. Artemis es una nucleasa y se cree que solo es necesaria para la reparación de DSB con extremos dañados, mientras que la ADN Ligasa IV y XLF son necesarias para todos los eventos NHEJ. Las mutaciones en genes que participan en la unión de extremos no homólogos provocan ataxia-telangiectasia (gen ATM), anemia de Fanconi (genes múltiples), así como cánceres de mama y de ovario hereditarios (gen BRCA1).
Muchos genes NHEJ han sido eliminados en ratones . La eliminación de XRCC4 o LIG4 provoca letalidad embrionaria en ratones, lo que indica que NHEJ es esencial para la viabilidad en mamíferos. Por el contrario, los ratones que carecen de Ku o DNA-PKcs son viables, probablemente porque aún pueden producirse niveles bajos de unión de extremos en ausencia de estos componentes. [39] Todos los ratones mutantes NHEJ muestran un fenotipo SCID, sensibilidad a la radiación ionizante y apoptosis neuronal.
Se desarrolló un sistema para medir la eficiencia de NHEJ en el ratón. [40] La eficiencia de NHEJ podría compararse entre tejidos del mismo ratón y en ratones de diferentes edades. La eficiencia fue mayor en los fibroblastos de la piel, los pulmones y los riñones, y menor en los fibroblastos del corazón y los astrocitos cerebrales. Además, la eficiencia de NHEJ disminuyó con la edad. La disminución fue de 1,8 a 3,8 veces, dependiendo del tejido, en los ratones de 5 meses en comparación con los de 24 meses. La capacidad reducida de NHEJ puede conducir a un aumento en el número de roturas de doble cadena del ADN no reparadas o reparadas de manera defectuosa que luego pueden contribuir al envejecimiento. [41] (Consulte también la teoría del envejecimiento sobre el daño al ADN ). Un análisis del nivel de la proteína NHEJ Ku80 en humanos, vacas y ratones indicó que los niveles de Ku80 varían dramáticamente entre especies, y que estos niveles están fuertemente correlacionados con la longevidad de las especies. [42]